結腸癌血清IGF-1水平及腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達與淋巴結轉移的相關性研究

楊秀成 于瓊 鞏林強 楊艷★

結腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，發病率僅次于肺癌和乳腺癌，其發生原因與飲食、環境、種族、遺傳等多種因素有關[1]。血管內皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族中的成員之一，血管內皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3）是酪氨酸激酶家族成員之一，胚胎發育早期在心血管系統中表達，成年之后，僅在淋巴內皮上表達[2]，而在結直腸正常組織中檢測不到表達[3]。胰島素生長因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）是一種具有細胞增殖調控作用的低分子多肽，在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態，并參與腫瘤細胞的增殖、轉移過程[4]。本研究通過檢測結腸癌患者血清IGF-1水平及腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達情況，分析三者間關系，以期為結腸癌患者預后提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

血清樣本和組織標本均來自于2016年5月至2017年7月本院接受手術治療的60例結腸癌患者和60例結腸腺瘤患者，分別作為結腸癌組和結腸腺瘤組，同一結腸癌組織標本癌旁正常組織作為癌旁正常組。結腸癌和癌旁正常組中，男36例，女24例，年齡46～77歲，平均（61.22±7.68）歲；結腸腺瘤組中，男33例，女27例，年齡45～75歲，平均（62.18±6.25）歲。另選取60例體檢健康者作為健康組，其中男性35例，女性25例，年齡44～78歲，平均（61.82±7.36）歲，3組性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。健康組收集血清作為對照，血清樣本貯存于-80°冰箱備用。結腸癌組、結腸腺瘤組、癌旁正常組的組織標本采用福爾馬林固定，石蠟包埋后備用。本實驗經本院倫理委員會批準同意，所有患者均簽署知情同意書。

結腸癌組納入標準：①經腸鏡活檢或手術檢查確診；②符合《常見消化系腫瘤診治學》[5]中結腸癌診斷標準。排除標準：①術前接受相關治療；②肛管癌、結直腸多發性息肉者；③有手術禁忌證者；④處于妊娠期或哺乳期者。

結腸腺瘤組納入標準：①均采用手術切除治療；②符合《常見消化系腫瘤診治學》[5]中結腸腺瘤診斷標準。排除標準；①合并腎功能障礙、陳舊性心肌梗死、冠心病者；②嚴重潰瘍性結腸炎者；③伴有腸內容物潴留者；④處于妊娠期或哺乳期者。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF-C多克隆抗體（E-AB-33567）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗人VEGFR-3多克隆抗體（bs-1083R-1）購自上海恒斐生物科技有限公司；鼠抗人D2-40 單克隆抗體（ZM-0465）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；即用型快捷免疫組化MaxVision TM 試劑盒（KIT-5002）購自福州邁新生物技術開發有限公司；二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（ZLI-9019-10ML）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IGF-1 酶聯免疫吸附試劑盒（XNDW36）購自上海旭年生物科技有限公司。

1.3 IGF-1 檢測方法

采集受試者清晨空腹靜脈血5 mL，獲取血清，根據酶聯免疫吸附試劑盒說明書步驟檢測血清IGF-1水平。

1.4 免疫組化方法

石蠟連續切片，厚度控制在4～5 μm 作用，采用3%過氧化氫處理10 min 左右，將內源性過氧化物酶阻斷。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗干凈后，熱修復15 min。PBS 沖洗3次，一抗4℃封閉過夜，PBS 沖洗干凈后，二抗常溫下孵育20 min。然后PBS 充分沖洗，二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色后采用蘇木素復染。最后脫水、透明、封片，進行鏡檢。

結果判定[6]：在腫瘤區選取5個視野，根據陽性細胞所占比例評分，低于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%之間為2分，51%～75%為3分，75%以上為4 分；根據染色強度評分，不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。通過兩者乘積判斷結果，即0～4 分為陰性，5 分以上為陽性。

1.5 微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density，LMVD）的判定

D2-40 陽性產物表達于淋巴管內皮細胞胞漿及細胞膜，按照Weidner 法計算LMVD，先于低倍鏡下選取熱點，然后調整至200倍鏡，選取4個視野計算微淋巴管總數，LMVD值取其均值[7]。

1.6 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行分析，計量數據用（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析計數資料用%表示，行χ2檢驗，多組之間兩兩比較采用卡方分割比較。相關性分析采用Spearman 等級相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清IGF-1水平比較

3組間血清IGF-1水平比較，結腸癌組血清IGF-1水平顯著高于結腸腺瘤組和健康組差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清IGF-1水平比較[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

表1 各組血清IGF-1水平比較[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

注：結腸癌組與健康組比較，q=24.829，aP=0.000，結腸癌組與結腸腺瘤組比較，q=7.919，bP=0.000。

組別結腸癌組結腸腺瘤組健康組F 值P 值n 60 60 60 IGF-1（ng/mL）145.83±18.32ab 123.27±12.30 82.52±7.38 49.538 0.000

2.2 各組VEGF-C和VEGFR-3表達情況比較

結腸癌組的細胞胞質中可見棕黃色染色顆粒，VEGF-C和VEGFR-3表達呈陽性，見圖1A，圖1B。3組間VEGF-C和VEGFR-3 陽性表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），結腸癌組VEGF-C和VEGFR-3 陽性表達率明顯高于結腸腺瘤組和癌旁組（P＜0.05）。見表2。

圖1 結腸癌腫瘤組織中VEGF-C和VEGFR-3 呈陽性表達（SP 法，200×）Figure1 Positive expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in colon cancer tumor tissues（SP 法，200×）

表2 各組VEGF-C和VEGFR-3表達情況比較[n（%）]Table2 Comparison of expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in each group[n（%）]

2.3 結腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達與病理特征關系

結腸癌患者血清IGF-1水平與腫瘤直徑、分化程度、浸潤程度和淋巴結轉移有關，結腸癌腫瘤組織VEGF-C 陽性表達與分化程度、浸潤程度和淋巴結轉移有關，結腸癌腫瘤組織VEGFR-3 陽性表達與浸潤程度和淋巴結轉移有關差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.4 LMVD值與結腸癌病理特征關系

淋巴管在腫瘤組織中分布不均，腫瘤邊緣區域的LMVD 明顯高于腫瘤內部區域，且邊緣區域淋巴管形態不一，多呈擴張狀態，而內部區域淋巴管多表現為無腔、條索狀，為無功能型。結腸癌組LMVD值為（3.86±1.14），結腸腺瘤組LMVD值為（1.45±0.41），癌旁組LMVD值為（0.76±0.16），結腸癌組LMVD值明顯高于結腸腺瘤組和癌旁組（q1=15.409，q2=20.859，P＜0.05）。LMVD值與結腸癌浸潤程度和淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表4。

表3 結腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達與病理特征關系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

表3 結腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達與病理特征關系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

病理特征性別年齡（歲）腫瘤直徑（cm）分化程度浸潤程度淋巴結轉移男女＜60≥60＜5≥5高、中分化低分化T1-T2 T3-T4有無n 36 24 15 45 23 37 49 11 41 19 37 23 IGF-1（ng/mL）147.28±15.84 143.93±14.05 144.28±13.04 146.63±16.22 139.54±14.89 156.32±16.21 136.93±17.66 155.52±13.47 132.05±17.34 156.20±13.94 158.73±15.96 133.29±14.31 P 值0.405 0.508 0.000 0.002 0.000 0.000 VEGF-C 陽性23（63.89）14（58.33）9（60.00）28（62.22）13（56.52）24（64.86）27（55.10）10（90.01）21（51.22）16（84.21）28（75.68）9（39.13）P 值0.665 0.878 0.518 0.027 0.014 0.005 VEGFR-3 陽性22（61.11）13（54.17）9（60.00）26（57.78）11（47.83）24（64.86）27（55.10）8（72.72）20（48.78）15（78.95）26（70.27）9（39.13）P 值0.593 0.880 0.193 0.284 0.027 0.017

表4 LMVD值與結腸癌病理特征關系Table4 Relationship between LMVD value and pathological features of colon cancer

2.5 血清IGF-1與組織VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 的相關性分析

IGF-1與VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相關（r=0.68，r=0.66，r=0.55，P＜0.05），VEGF-C和VEGFR-3與LMVD 均呈正相關（r=0.60，r=0.62，P＜0.05）。

3 討論

隨著飲食結構和生活習慣的改變，結腸癌發病率呈逐年上升趨勢，我國新發病例約為1.3萬[8]。手術治療是結腸癌的主要治療方法，并輔以免疫、化療、中藥等綜合治療方案。治療后1～3年內，許多患者會出現腫瘤轉移或復發，而腫瘤的轉移和復發與腫瘤侵襲、轉移密切相關[9]。許多研究證實微血管的形成可促進腫瘤侵襲、轉移[10]，但關于微淋巴管形成對腫瘤發生發展的影響尚需進一步探究。

IGF-1 是主要由肝臟合成的具有細胞增殖和凋亡調控作用的多肽類生長因子，動物實驗表明，IGF-1 基因缺失的結直腸癌小鼠與對照組小鼠相比，腫瘤生長緩慢，發病率明顯降低，說明IGF-1 在腫瘤的發生過程中起到促進作用[11]。本研究結果顯示與田曉慧等人[12]研究結果一致。分析原因可能是IGF-1 通過與其受體結合激活酪氨酸酶活性，啟動PI3K/AKT和MAPK 信號通路，進而促進癌細胞增殖分化，抑制癌細胞凋亡[13]。本研究進一步分析結果顯示，腫瘤直徑≥5 cm、低分化、浸潤程度深、有淋巴結轉移的血清IGF-1水平明顯較高，說明較高血清水平的IGF-1 可促進腫瘤生長、浸潤與淋巴結轉移。

在淋巴管生成和淋巴結轉移研究中，VEGF-C和VEGFR-3為熱門研究因子。本研究發現VEGFC和VEGFR-3 在結腸癌腫瘤組織中均表達上調，且浸潤程度較深和伴有淋巴結轉移的患者VEGF-C和VEGFR-3 陽性率均明顯高于浸潤程度淺、無淋巴結轉移患者，提示VEGF-C和VEGFR-3可促進結腸癌的侵襲和轉移過程，與在食管癌[14]、胃癌[15]等研究中結果一致。

本研究發現，結腸癌組LMVD值明顯高于結腸腺癌組，且浸潤程度深、伴有淋巴結轉移組織中LMVD值較浸潤程度淺和無淋巴結轉移組織中LMVD值較高，提示LMVD值與結腸癌淋巴結轉移密切相關。因為腫瘤邊緣區域淋巴管管壁基底膜不連續，腫瘤細胞易進入新生淋巴管，有利于腫瘤細胞的淋巴結轉移[16]。張澤進等人[17]相關研究顯示，結腸癌組織VEGFR-C、VEGFR-3與LMVD呈正相關，本研究與上述研究結果一致。IGF-1與淋巴結轉移有關，但是否與LMVD 及VEGF-C和VEGFR-3表達存在一定聯系，國內尚未見相關文獻報道。本研究結果顯示，IGF-1與VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相關，推測可能與IGF-1通過與其受體結合激活PI3-K 信號通路，誘導VEGF-C 表達上調有關，而VEGF-C 作為淋巴生成的關鍵因素，可激活VEGFR-3 以及后續一系列信號傳導通路，促進淋巴管內皮增殖，在腫瘤邊緣區域形成新生微淋巴管，提高淋巴結轉移發生率[18-19]。

綜上所述，結腸癌血清IGF-1水平以及組織中VEGF-C和VEGFR-3表達均明顯升高，高血清水平的IGF-1和VEGF-C和VEGFR-3 的陽性表達與結腸癌淋巴轉移密切相關，所以結腸癌血清IGF-1水平的檢測可在術前一定程度評估結腸癌惡化程度，且血清學檢測操作簡單方便，可能可作為預測腫瘤發生發展的新的生物標志物。另外IGF-1、VEGF-C和VEGFR-3 互呈正相關，共同促進微淋巴管形成，阻斷IGF-1水平的升高可能成為減少VEGF-C和VEGFR-3表達，抑制結腸癌發展的新途徑。