狼瘡性腎炎血清MMP9、IFN-γ與HMGB1、TLR4 mRNA的臨床意義

魯冰 任東升★ 陶雅非 栗明

狼瘡性腎炎（Lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）最為常見和嚴重的并發癥，5%～20%患者十年內進展為終末期腎病，病死率較高[1]。LN 常累及心臟，根據相關報道，其發生率為52%～98%，可影響患者預后，且不易診斷[2]。基質金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）定位于染色體20q11.1～13.1，根據申曉莉等[3]研究，其在慢性心力衰竭患者中呈高表達，并能影響患者心功能。干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）是水溶性二聚體細胞因子，與自身免疫類疾病的發生有關[4]。高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1 protein，HMGB1）具有調節基因轉錄、穩固胞核結構的功能，近年來研究發現HMGB1 亦是一種免疫反應相關因子[5]。Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）是參與非特異性免疫的一類重要分子，Chen X 等[6]研究指出，TLR 通路在心力衰竭期間能通過自噬作用促進心肌細胞凋亡。本實驗探討LN 外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 的表達意義及與心臟損害相關性，報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年8月至2019年7月本院收治的63例LN 患者（LN組）及34例LN 合并心臟損害患者（合并心臟損害組），均符合LN 診斷標準[7]，心臟損害標準根據左心室質量指數（Left ventricular mass index，LVMI）劃分，即女性、男性分別＞106、114 g/m2，排除入組前1個月內發生過急性心血管事件患者、先天性心臟病患者、合并惡性腫瘤者、存在感染類疾病者。

1.2 方法

采集肘部靜脈血5 mL，分別采用上海康朗生物科技有限公司、深圳市科潤達生物工程有限公司酶聯免疫吸附法試劑盒檢測血清MMP9、IFN-γ水平；采用熒光定量PCR檢測HMGB1、TLR4 水平，取適量外周血標本，加入Ficoll 分離液，離心，取中間層懸浮細胞，磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗，離心，獲得外周血單個核細胞，提取RNA，逆轉錄，配置反應體系，包括引物、4種dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA和PCR反應緩沖液共20 μL，HMGB1 上下游引物分別為5′-TGGCAAAGGCTGACAAGGCTC-3′、5′-GGATGCTCGCCTTTGATTTTGG-3′，TLR4 上下游引物分別為5′-ATTCCTGCAGTGGGTCAA GG-3′、5′-ACAATTCCACCTGCTGCC TC-3′，GAPDH 上下游引物分別為5′-CAAATTCAACGGCACAGTCAA-3′、5′-TGGTGAAGACACCAGTAGACT C-3′，基因的表達水平以相對GAPDH 來表示。

1.3 觀察指標

①比較兩組一般資料。②比較兩組外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA的表達。③根據2003年國際腎臟病學會和腎臟病理學會（ISN/RPS.2003）病理分型[8]劃分LN 患者為Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ型，比較不同LN 病理分型患者外周血各指標水平。④分析影響LN 合并心臟損害發生的因素。⑤分析各指標與心臟損害的相關性。⑥分析各指標診斷LN 合并心臟損害的價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行處理數據，計量資料以（）表示、t檢驗，計數資料用n（%）表示、χ2檢驗，以Logistic多元回歸方程行多因素分析，采用Pearson 進行相關性分析，采用接收者操作特征（ROC）曲線及ROC 下面積（AUC）分析各指標診斷LN 合并心臟損害的價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡、病程、LN 活動性指數、病理分型比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組外周血中各指標表達比較

合并心臟損害組MMP9、IFN-γ、HMGB1mRNA、TLR4mRNA水平均較LN組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組臨床資料對比（±s）Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups（±s）

表1 兩組臨床資料對比（±s）Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups（±s）

組別LN組合并心臟損害組χ2/t 值P 值n 63 34男/女27/36 12/22 0.525 0.469年齡（歲）（34.89±12.35）（35.05±13.97）0.058 0.954病程（月）（18.06±4.46）（17.91±6.41）0.135 0.893 LN 活動性指數（分）（5.21±1.08）（5.33±1.14）0.512 0.610 ISN/RPS.2003 病理分型Ⅰ5（7.94）1（2.94）1.283 0.733Ⅱ27（42.86）15（44.12）Ⅲ23（36.51）12（35.29）Ⅳ8（12.70）6（17.65）

表2 兩組外周血中各指標表達水平的比較（±s）Table2 Comparison of the expression levels of various indicators in peripheral blood between the 2 groups（±s）

表2 兩組外周血中各指標表達水平的比較（±s）Table2 Comparison of the expression levels of various indicators in peripheral blood between the 2 groups（±s）

組別LN組合并心臟損害組t 值P 值n 63 34 MMP9（ng/mL）381.92±112.03 458.67±126.14 3.079 0.003 IFN-γ（pg/mL）211.62±65.75 274.40±83.69 4.070＜0.001 HMGB1 mRNA 2.91±0.95 3.89±1.11 4.567＜0.001 TLR4 mRNA 1.36±0.42 1.84±0.56 4.765＜0.001

2.3 比較不同LN 病理分型患者外周血各指標表達水平比較

Ⅲ+Ⅳ型患者MMP9、IFN-γ、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA水平均較Ⅰ+Ⅱ型高（P＜0.05）。見表3。

表3 比較不同LN 病理分型患者外周血中各指標的表達（±s）Table3 Comparison of the expression of various indexes in peripheral blood of patients with different ln pathological types（±s）

表3 比較不同LN 病理分型患者外周血中各指標的表達（±s）Table3 Comparison of the expression of various indexes in peripheral blood of patients with different ln pathological types（±s）

組別Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳt 值P 值n 48 49 MMP9（ng/mL）380.19±105.27 436.87±128.45 2.374 0.020 IFN-γ（pg/mL）174.97±68.59 291.09±75.42 7.928＜0.001 HMGB1 mRNA 2.71±0.91 3.78±1.07 6.903＜0.001 TLR4 mRNA 1.11±0.46 1.94±0.48 8.692＜0.001

2.4 影響LN 合并心臟損害發生因素的分析

MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 是LN 合并心臟損害發生的相關危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響LN 合并心臟損害發生因素的Logistic多元回歸方程分析Table4 logistic multiple regression equation analysis of factors affecting ln combined with heart damage

2.5 各指標與心臟損害的相關性分析

MMP9（r=0.259，P=0.010）、IFN-γ（r=0.424，P＜0.001）、HMGB1mRNA（r=0.467，P＜0.001）、TLR4mRNA（r=0.480，P＜0.001）與心臟損害呈正相關。見圖1。

2.6 各指標診斷LN 合并心臟損害的價值分析

HMGB1mRNA 診斷LN 合并心臟損害的AUC 大于其他指標，表5。

3 討論

圖1 各指標與心臟損害的相關性圖Figure1 correlation chart of each index and heart damage

表5 ROC 分析結果Table5 ROC analysis results

MMP9 可由成纖維細胞、單核細胞、中性粒細胞等分泌，以往關于其在惡性腫瘤領域的研究較多，在LN 及LN 合并心臟損害中的報道較少。Vira H 等[9]研究納入了150例SLE 患者，發現MMP9 可增加SLE 患病風險，并與SLE 疾病活動指數有關。Ugarte-Berzal E 等[10]研究指出，MMP9 可激活免疫復合物中C1，造成腎臟損傷。Mao YM 等[11]進行的一項meta 分析發現，SLE 患者外周血MMP9 水平高于無SLE 正常人群。提示高MMP9水平與SLE 有關，故可能與LN 亦有關。本研究發現，MMP9 在LN 合并心臟損害組、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表達，與LN 發生心臟損害、LN 病理分型有關。曲哲等[12]構建MMP9-siRNA 慢病毒，對急性心肌缺血再灌注大鼠模型進行干預，發現干預后大鼠生存率提高，左室收縮末期內徑、左室舒張末期內徑、左心室質量指數較模型組減少，提示沉默MMP-9 表達可減輕缺血再灌注損傷和心室重構，改善心室功能，從側面論證了本研究。LN 本質是一種自身免疫疾病，多種細胞因子、免疫細胞參與了疾病的發生。IFN-γ 是其中主要的細胞因子之一，馬松鶴等[13]研究采用降植烷誘導建立SLE 小鼠模型，發現與正常小鼠比較，模型小鼠血清中IFN-γ 水平顯著升高，并造成腎組織病理變化。張娜[14]的報道中，采用人參皂苷Rg1 抑制IFN-γ 的產生，發現實驗動物Th1/Th2 平衡及病情得到改善。可見高水平IFN-γ 可損傷腎組織，加重病情。根據Wen S 等[15]研究，IFN-γ 在LN 患者外周血、腎臟組織中均呈高表達，與疾病活動度密切相關。本研究發現，IFN-γ 在LN 合并心臟損害組、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表達，與LN 發生心臟損害、LN 病理分型有關。運鋒等[16]研究指出，IFN-γ 在急性病毒性心肌炎小鼠模型心肌組織中呈高表達，采用蘇木乙酸乙酯提取物降低IFN-γ 的表達后，光鏡下可見心肌病理形態學得到改善，可見IFN-γ與心肌損傷有關，支持本研究結論。IFN-γ 診斷LN合并心臟損害可為臨床診斷LN 合并心臟損害提供參考。

TLR4 主要表達于單核巨噬細胞表面，可介導對病原分子模式及內源性表位的識別，連接天然免疫與獲得性免疫，在人體免疫系統中起到重要作用。本研究發現，HMGB1、TLR4 在LN 合并心臟損害組、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表達，與LN 發生心臟損害、LN 病理分型有關。Song E 等[17]研究TLR4 可通過激活HMGB1，增加心臟活檢樣本中炎性體的激活，造成心臟功能障礙，均支持本研究結論。同時診斷LN 合并心臟損害的AUCHMGB1mRNA＞TLR4mRNA，可為臨床診斷LN 合并心臟損害提供參考。值得注意的是，由于本研究客觀實際病例數較少，可能造成數據存在偏倚，更可靠結果有待后續進一步驗證。

綜上所述，LN 患者外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 高表達，與病理分型有關，并可作為心臟損害的參考指標。