CD3+HLA-DR細胞與POI患者免疫紊亂及卵巢功能的關系

郭蜜甜 張繼 王素梅

早發性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）多發生于女性40歲之前，發生率約為1.0%～2.0%[1]，主要表現為血清促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌二醇（Estradiol 2，E2）水平上升，雌激素水平下降，會引發卵巢功能衰竭，誘導閉經提前[2]。目前臨床尚未完全明確POI 發病機制，相關研究發現，POI患者與自身免疫紊亂存在密切聯系，最終會引發卵泡缺失，或誘發卵泡對FSH 反應低下，降低卵巢功能[3]。同時，相關研究還顯示，POI患者外周血中存在細胞免疫、體液免疫改變現象[4]。另外，有學者指出，人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）主要表達于多種淋巴細胞上，在免疫反應中具有關鍵作用[5]。然而關于CD3+HLA-DR細胞與POI患者細胞免疫、體液免疫、卵巢儲備功能關聯性研究鮮有報道。本研究旨在探討CD3+HLA-DR細胞與POI患者免疫紊亂、卵巢功能的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2018年1月至2019年9月POI患者136例作為觀察組，另選取同期健康育齡女性130例作為對照組。本研究均經本院醫學倫理委員會審批同意。

納入標準：①觀察組符合《2016 ESHRE 指南：女性過早卵巢功能不全的管理》中POI 診斷標準[6]，并經陰道超聲檢查確診；年齡＜40歲；月經稀發或停經時間≥4個月；均伴有月經改變、生育力低減等臨床癥狀；FSH 水平＞40 U/L，E2 水平＞183 pmol/L；②對照組月經正常，未合并其他婦科炎癥；③兩組臨床資料均完整，且患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①卵巢抵抗綜合征、多囊卵巢綜合征、卵巢不敏感綜合征、功能性下丘腦性閉經或完全性雄激素不敏感綜合征者；②合并甲狀腺功能亢進或減退者；③生殖道發育異常者；④妊娠或哺乳期女性；⑤卵巢手術或化療所致卵巢衰竭者；⑥盆腔占位性病變或盆腔炎癥者；⑦近4 周內有免疫抑制劑、激素或抗腫瘤藥物服用史者；⑧精神行為異常者。

根據住院相關文獻、病歷資料等，設計臨床研究表（CRF），主要調查年齡、初潮年齡、體質量指數、停經時間、產婦類型等內容。

1.2 方法

空腹取8mL 靜脈血：①離心分離外周血淋巴細胞，采用PE-conjugated Anti-HLA-DR、FITC-anti-CD3 的同型單克隆抗體進行孵育，應用流式細胞儀檢測CD3+HLA-DR 抗原淋巴細胞的表達水平，儀器購自美國BD 公司；②應用流式細胞儀檢測CD3+、CD8+、CD4+水平；③離心12 min，3 000 rpm，取血清，采用免疫比濁法檢測免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、IgM、IgG（上海瑞番生物科技有限公司）；采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清抗苗勒氏管激素（Anti-mullerian hormone，AMH）（上海雅吉生物科技有限公司），上述均嚴格按照儀器、試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件分析處理數據，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗；計量資料采用（）表示，兩組間用t檢驗，采用Pearson 進行相關性分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

兩組年齡、初潮年齡、體質量指數、停經時間、產婦類型比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）Table1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）Table1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

一般資料年齡（歲）初潮年齡（歲）體質量指數（kg/m2）停經時間（個月）孕次（次）產婦類型初產婦經產婦觀察組（n=136）32.74±2.59 13.48±0.22 22.89±1.64 7.92±1.15 1.98±0.40 79（58.09）57（41.91）對照組（n=130）33.05±2.17 13.50±0.20 23.11±1.49 8.01±1.29 2.00±0.39 75（57.69）55（42.31）t/χ2值1.056 0.775 1.144 0.601 0.413 0.004 P 值0.292 0.439 0.254 0.548 0.680 0.948

2.2 兩組外周血CD3+HLA-DR細胞

觀察組外周血CD3+HLA-DR細胞比例（13.52±2.49）%，對照組外周血CD3+HLA-DR細胞比例（8.77±1.63）%。兩組比較，觀察組外周血CD3+HLA-DR細胞比例高于對照組，差異有統計學意義（t=18.319，P＜0.001）。

2.3 兩組免疫指標

觀察組血清IgA、IgM、IgG 水平低于對照組，CD3+、CD8+水平高于對照組、CD4+低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組免疫指標比較（±s）Table2 Comparison of immune indexes between the 2 groups（±s）

表2 兩組免疫指標比較（±s）Table2 Comparison of immune indexes between the 2 groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 136 130體液免疫指標（g/L）IgA 1.34±0.26 1.83±0.37 12.541＜0.001 IgM 1.55±0.32 2.06±0.40 11.508＜0.001 IgG 8.69±1.61 12.42±2.08 16.397＜0.001細胞免疫指標（%）CD3+72.84±5.01 68.03±4.12 8.531＜0.001 CD8+34.82±4.77 26.11±3.96 16.165＜0.001 CD4+32.43±3.20 38.72±4.55 13.088＜0.001

2.4 外周血CD3+HLA-DR細胞與體液免疫、細胞免疫相關性

外周血CD3+HLA-DR細胞與CD4+、血清IgA、IgM、IgG 呈負相關，與CD3+、CD8+呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1～2。

2.5 兩組卵巢儲備功能

觀察組血清AMH、AFC、子宮內膜厚度低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

圖1 外周血CD3+HLA-DR細胞與體液免疫相關性Figure1 correlation between peripheral blood CD3+HLA-DR cells and humoral immunity

圖2 外周血CD3+HLA-DR細胞與細胞免疫相關性Figure2 correlation between peripheral blood CD3+HLA-DR cells and cellular immunity

表3 兩組卵巢儲備功能比較（±s）Table3 Comparison of ovarian reserve function between the 2 groups（±s）

表3 兩組卵巢儲備功能比較（±s）Table3 Comparison of ovarian reserve function between the 2 groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 136 130血清AMH（ng/mL）1.15±0.04 5.27±1.80 26.688＜0.001 AFC（個）1.28±0.64 5.65±2.19 22.298＜0.001子宮內膜厚度（mm）3.82±0.63 6.47±1.56 18.311＜0.001

2.6 外周血CD3+HLA-DR細胞與卵巢儲備功能關聯性

外周血CD3+HLA-DR細胞與血清AMH、AFC、子宮內膜厚度呈負相關（P＜0.05），見圖3。

3 討論

相關文獻報道，組織中HLA-DR 抗原表達異常，會誘導抗原呈遞細胞將自身抗原遞呈至輔助T細胞，從而啟動、延續自身免疫反應[7]。宗國霞等[8]通過對比63例POI患者、40例健康育齡女性，結果表明，外周血CD3+HLA-DR細胞水平在POI患者呈明顯異常高表達，與本研究觀點一致，提示外周血CD3+HLA-DR細胞水平可能參與POI 發生、發展。HLA-DR 作為MHCⅡ分子，具有抗原呈遞作用，一定程度會激活自身免疫應答，誘導B 細胞形成自身抗體，從而對卵泡產生攻擊、破壞，增加卵巢早衰發生率。同時，本研究采用流式細胞儀檢測還發現，POI患者CD4+、血清IgA、IgM、IgG水平明顯低于健康育齡女性、CD3+、CD8+水平高于健康育齡女性，與謝樹紅[9]結果相似，有力佐證了POI患者機體存在T細胞介導的免疫損傷表現。T細胞亞群中輔助細胞、殺傷抑制細胞紊亂，會分化制造IgA 等免疫球蛋白，攻擊顆粒細胞等卵巢靶細胞，引發卵泡過度閉鎖，誘導卵巢細胞凋亡，增加排卵障礙發生危險性，從而迅速降低卵泡數量，提高POI 發生風險[10-11]。經Pearson 相關性進一步證明，外周血CD3+HLA-DR細胞與CD4+、血清IgA、IgM、IgG 存在負相關關系，與CD3+、CD8+存在正相關關系，充分說明CD3+HLA-DR細胞能有效反映POI患者機體細胞免疫紊亂狀態，原因考慮與CD3+HLA-DR細胞能激活POI患者機體輔助性T細胞，識別自身抗原，誘發自身免疫反應有關。

周燦權等[12]認為，卵泡過早衰竭的主要原因為卵巢內卵泡數目降低，閉鎖卵泡數目上升。AMH 在卵泡障礙性疾病發生中起著關鍵作用，能阻礙原始卵泡初始募集，減少原始卵泡耗損，減輕生長卵泡對FSH 刺激的反應性，干擾卵泡選擇。同時，國外研究認為，AMH 水平下降及其在特定時期迅速減少是卵巢儲備功能低下的重要標志[13]。AFC 是卵巢儲備功能的標志物，李曼等[14]觀點表明，AFC 異常表達一定程度能反映卵泡成熟度。另外，采用陰道超聲檢查子宮內膜厚度有助于監測卵泡發育程度，為評估卵巢儲備功能提供數據支持。本研究發現，POI患者血清AMH、AFC、子宮內膜厚度均低于健康育齡女性，提示POI患者存在卵巢儲備功能下降現象。T細胞調節介導的自身免疫反應是POI 的病理基礎，而T細胞活化可能會加快對卵巢顆粒細胞的免疫應答，進而加重卵巢顆粒細胞損傷[15]，減少血清AMH、AFC，降低子宮內膜厚度，損傷卵巢儲備功能。進一步研究外周血CD3+HLA-DR細胞與POI患者卵巢儲備功能關聯性顯示，外周血CD3+HLA-DR細胞與血清AMH、AFC、子宮內膜厚度存在明顯負相關關系，CD3+HLA-DR細胞可能通過與浸潤淋巴細胞相互作用，促進黃體溶解，調控POI患者FSH、E2 等性激素水平，影響卵巢存儲功能，可見外周血CD3+HLA-DR細胞有望成為調節POI患者卵巢儲備功能的重要T細胞亞群。

圖3 外周血CD3+HLA-DR細胞與卵巢儲備功能關聯性Figure3 correlation between peripheral blood CD3+HLA-DR cells and ovarian reserve function

綜上可知，外周血CD3+HLA-DR細胞在POI患者中呈異常升高表達，并與POI患者免疫紊亂、卵巢功能存在一定相關性，有望成為調控POI患者免疫應答、改善卵巢儲備功能的重要T細胞亞群。