miR-421靶向PDCD4促進前列腺癌DU145細胞增殖的實驗研究

李作為 郭航 鄧超 燕東亮 田斌強

前列腺癌是常見的男性生殖系統惡性腫瘤，我國前列腺癌的發病率也呈逐年升高的趨勢[1-3]。前列腺癌的發病機制未完全闡明，臨床上也缺乏前列腺癌的靶向治療手段。微小RNA（microRNA，miR）是具有廣泛生物學作用的非編碼小分子RNA，在多種惡性腫瘤的發生發展中起抑癌或促癌作用。miR-421 是一種具有促癌作用的miR，前列腺癌相關的臨床研究表明，miR-421 在前列腺癌患者血清及組織中的表達均明顯增加[4]；乳腺癌和肺癌中miR-421 相關的細胞實驗表明，miR-421 能夠靶向抑癌基因細胞程序性死亡基因4（programmed cell death 4，PDCD4）并抑制乳腺癌細胞的增殖[5-6]；前列腺癌中PDCD4 相關的細胞實驗表明，過表達PDCD4 能夠顯著抑制前列腺癌細胞的增殖[7]。但miR-421 對前列腺癌增殖的調控作用及機制尚未闡明。為此，本實驗將以前列腺癌DU145細胞為對象，具體分析miR-421 靶向PDCD4 促進細胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺癌DU145 株購自美國ATCC；四唑化合物[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS]細胞增殖試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測系統購自瑞士Promega 公司；miR-421 模擬物及陰性對照miR-NC、PDCD4 過表達載體（pcDNAPDCD4）及空白對照pcDNA、野生型及突變型PDCD4 熒光素酶報告基因均由上海吉瑪公司構建；總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成預混試劑盒、Talent 熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司；PDCD4 抗體購自Abcam 公司、β-actin 抗體購自Sigma 公司，二抗購自武漢艾美捷公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

DU145細胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640 培養基進行貼壁培養，培養條件為37℃、飽和濕度、5% CO2，細胞鋪滿培養瓶底面90%后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，用于后續分組處理。

1.2.2 細胞分組處理

消化后的DU145細胞稀釋至1×106/mL，接種在6 孔培養板中，細胞融合至50%～60%時進行分組，對照組用不含脂質體的RPMI-1640 培養基處理，miR-NC組和miR-421組分別用脂質體轉染miR-NC 及miR-421，miR-421+pcDNA組用脂質體轉染miR-421 及pcDNA，miR-421+pcDNA-PDCD4組用脂質體轉染miR-421 及pcDNA-PDCD4，轉染過程均按脂質體的說明書進行操作。

1.2.3 細胞增殖活力的檢測

DU145細胞轉染48 h 后，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，調節細胞密度至1×104/mL，按照每孔200 μL 接種在96 孔培養板中，繼續培養24、48、72 h 后，分別進行MTS 實驗，每孔加入MTS 試劑盒的檢測液20 μL，繼續培養4 h 后，在酶標儀上檢測490 nm 波長處的吸光值。

1.2.4 細胞中PDCD4mRNA 表達的檢測

DU145細胞轉染48 h 后，棄去培養基、保留細胞，根據總RNA 提取試劑盒的說明書操作、提取細胞中RNA，然后以RNA為模板、根據cDNA 第一鏈合成預混試劑盒的說明書操作、將RNA 反轉錄為cDNA，最后按照Talent 熒光定量檢測試劑盒的說明書配置PCR 反應體系、進行PCR 反應，根據反應的循環曲線計算PDCD4的mRNA 表達水平。

1.2.5 細胞中PDCD4 蛋白表達的檢測

DU145細胞轉染48 h 后，棄去培養基、保留細胞，加入RIPA 裂解液，裂解細胞并提取蛋白，蛋白樣本與上樣緩沖液混合后加入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后電轉移至NC 膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC 膜1 h，加入1∶1 000稀釋的PDCD4 抗體或1∶5 000 稀釋的β-actin 抗體、4℃孵育過夜；第二天，洗膜3次后室溫孵育1∶1 000 稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，用ImageJ 軟件框選蛋白條帶并得到條帶的灰度值，計算PDCD4條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值、作為PDCD4 的蛋白表達水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗

DU145細胞轉染48 h 后，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，調節細胞密度至1×104/mL，按照500 μL/孔接種在24 孔板內，當細胞融合至50%～60%時，將野生型及突變型PDCD4 熒光素酶報告基因與miR-NC 或miR-421 共轉染進入細胞，48 h 后收集細胞并裂解，裂解后的上清液中加入熒光素酶底物，檢測螢火蟲熒光素的酶活性及海腎熒光素的酶活性，計算比值作為雙熒光素酶報告基因的熒光活力。

1.2.7 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析，計數資料以n表示，計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-421 過表達促進DU145細胞增殖

與對照組及miR-NC組比較，miR-421組DU145細胞在24、48、72 h 時的增殖活力均顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-421 過表達對DU145細胞增殖的影響（±s）Table1 Effect of miR-421 overexpression on proliferation of DU145 cell（±s）

表1 miR-421 過表達對DU145細胞增殖的影響（±s）Table1 Effect of miR-421 overexpression on proliferation of DU145 cell（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與miR-NC組比較，bP＜0.05。

組別對照組miR-NC組miR-421組F 值P 值24 h 0.42±0.08 0.45±0.06 0.69±0.11ab 14.864 0.001 48 h 0.61±0.09 0.58±0.10 0.83±0.17ab 5.947 0.016 72 h 0.74±0.13 0.77±0.17 1.08±0.24ab 5.140 0.024

2.2 miR-421 過表達抑制DU145細胞中PDCD4的表達

與對照組及miR-NC組比較，miR-421組DU145細胞中PDCD4的mRNA 表達水平及蛋白表達水平均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

2.3 miR-421 靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR

Targetscan 網站生物信息學預測顯示，PDCD4基因mRNA 3'UTR 中含有與miR-421 互補的核苷酸序列，見圖2；雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照組及miR-NC組比較，miR-421組DU145細胞中野生型PDCD4 熒光素酶報告基因的熒光活性顯著降低（P＜0.05），突變型PDCD4 熒光素酶報告基因的熒光活性無顯著變化（P＞0.05），見表3。

圖1 對照組、miR-NC組、miR-421組的PDCD4 蛋白條帶Figure1 Protein bands of PDCD in control group，miR-NC group，miR-421 group

表2 miR-421 過表達對DU145細胞中PDCD4 表達的影響（±s）Table2 Effect of miR-421 overexpression on PDCD4 expression of DU145 cell（±s）

表2 miR-421 過表達對DU145細胞中PDCD4 表達的影響（±s）Table2 Effect of miR-421 overexpression on PDCD4 expression of DU145 cell（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與miR-NC組比較，bP＜0.05。

組別對照組miR-NC組miR-421組F 值P 值PDCD4 mRNA 表達0.82±0.19 0.87±0.22 0.45±0.08 8.658 0.004 PDCD4 蛋白表達0.65±0.12 0.70±0.14 0.32±0.06 17.008 0.000

圖2 miR-421 靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 的生物信息學預測Figure2 Bioinformatics prediction of miR-421targeting 3'UTR of PDCD4 gene mRNA

表3 miR-421 過表達對DU145細胞中PDCD4 熒光素酶報告基因熒光活性的影響（±s）Table3 Effect of miR-421 overexpression on fluorescence activity of PDCD4 luciferase reporter gene of DU145 cell（±s）

表3 miR-421 過表達對DU145細胞中PDCD4 熒光素酶報告基因熒光活性的影響（±s）Table3 Effect of miR-421 overexpression on fluorescence activity of PDCD4 luciferase reporter gene of DU145 cell（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與miR-NC組比較，bP＜0.05。

組別對照組miR-NC組miR-421組F 值P 值野生型PDCD4 1.08±0.25 1.11±0.28 0.48±0.09ab 12.715 0.001突變型PDCD4 1.04±0.27 0.99±0.19 1.09±0.22 0.238 0.792

2.4 PDCD4 過表達逆轉miR-421 過表達調控DU145細胞增殖的作用

與miR-NC組比較，miR-421組DU145細胞中PDCD4 的蛋白表達量顯著降低，24、48、72 h 時的增殖活力均顯著增加（P＜0.05）；與miR-421+pcDNA組比較，miR-421+pcDNA-PDCD4組DU145細胞中PDCD4 的蛋白表達量顯著增加，24、48、72 h時的增殖活力均顯著降低（P＜0.05）。表4。

表4 PDCD4 過表達對miR-421 過表達調控DU145細胞增殖的影響（±s）Tabure 4 Effect of PDCD4 overexpression on miR-421 overexpression regulating proliferation of DU145 cell（±s）

表4 PDCD4 過表達對miR-421 過表達調控DU145細胞增殖的影響（±s）Tabure 4 Effect of PDCD4 overexpression on miR-421 overexpression regulating proliferation of DU145 cell（±s）

注：與miR-NC組比較，bP＜0.05；與miR-421+pcDNA組比較，cP＜0.05。

組別miR-NC組miR-421組miR-421+pcDNA組miR-421+pcDNA-PDCD4組F 值P 值PDCD4蛋白表達0.72±0.18 0.32±0.06b 0.36±0.07 0.71±0.20c 11.658 0.000增殖活力（OD490）24 h 0.45±0.06 0.69±0.11b 0.71±0.12 0.40±0.08c 14.078 0.000 48 h 0.58±0.10 0.83±0.17b 0.80±0.14 0.54±0.09c 6.634 0.004 72 h 0.77±0.17 1.08±0.24b 1.11±0.26 0.72±0.15c 4.689 0.016

3 討論

近年來，miR與惡性腫瘤發生發展的關系受到越來越多關注，miR 能夠在轉錄后水平調節抑癌基因或原癌基因表達，進而發揮促癌或抑癌作用。miR-421 是一種具有促癌作用的miR，在前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達的趨勢[4，8-10]，另有多項細胞實驗表明，miR-421 對乳腺癌、胃癌、骨肉瘤等惡性腫瘤細胞的增殖具有促進作用[11-13]，以上研究提示miR-421對多種惡性腫瘤的發生發展起促進作用。

本實驗分析了miR-421 在前列腺癌細胞增殖中的調控作用及機制。在離體培養的前列腺癌DU145細胞中，通過轉染miR-421 模擬物增加miR-421 的表達后，DU145細胞的增殖活力明顯增強，表明miR-421 對前列腺癌DU1415 細胞的增殖具有促進作用，這與前列腺癌組織中miR-421 高表達的趨勢吻合，也與既往其他研究報道的miR-421促進癌細胞增殖的作用一致。

miR 本身不編碼蛋白質，其生物學作用通過調控靶基因的表達來實現，miR與靶基因mRNA 3’UTR 結合后能夠促進mRNA 降解、阻礙mRNA翻譯。根據Wang Y[5]和Yang YN[6]的研究，抑癌基因PDCD4受到miR-421 的靶向調控。本實驗在Targetscan 網站中進行了生物信息學預測，miR-421 能夠靶向結合PDCD4基因mRNA 3'UTR 的第419-425 堿基；在過表達miR-421 后，DU145細胞中PDCD4的mRNA 表達水平及蛋白表達水平均明顯降低，表明miR-421 能夠抑制前列腺癌細胞中PDCD4 的表達。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-421 對PDCD4 的靶向結合可知，過表達miR-421 能夠使野生型PDCD4 雙熒光素酶報告基因的熒光活力降低，而將第419-425 堿基突變后、突變型PDCD4 雙熒光素酶報告基因的熒光活力不受miR-421 的影響，表明miR-421 能夠靶向結合PDCD4 基因mRNA 3'UTR 且結合位點與生物信息學預測一致、即第419-425 堿基。

PDCD4是重要的抑癌基因，相關研究表明，PDCD4 能夠直接封閉eIF4A的解螺旋酶活性、抑制eIF4A與eIF4G 的結合，也能阻礙PI3K/AKT 通路的激活，進而使細胞的增殖受阻[14-16]；此外，PDCD4 還能增強p21、p53 等抑癌基因的功能，進而誘導細胞凋亡[17]。國內張克克的細胞實驗表明，過表達PDCD4 能夠顯著抑制前列腺癌細胞的增殖[7]。結合本實驗的結果，miR-421 能夠靶向抑制PDCD4 的表達，提示靶向PDCD4 可能是miR-421 抑制前列腺癌細胞增殖的潛在分子機制。為了驗證這一機制，本實驗構建了過表達PDCD4 的載體，在過表達miR-421 的同時轉染過表達PDCD4 的載體，增加PDCD4 表達的同時也逆轉了miR-421 促進DU145細胞增殖的作用，由此表明靶向PDCD4 是miR-421促進前列腺癌DU145細胞增殖的可能分子機制。

綜上所述，miR-421 對前列腺癌DU145細胞的增殖具有促進作用，靶向抑制PDCD4 是miR-42 發揮這一作用的潛在分子機制，本研究的結果為將來探究miR-421 在前列腺癌靶向治療中的作用提供了理論依據。