敲低lncRNA DILC對膠質(zhì)瘤細胞體外生物學(xué)特性的影響

劉泉 王新軍 王建業(yè) 伍靜

腦膠質(zhì)瘤為常見腦部腫瘤，放療、化療、手術(shù)等均為其公認治療方法，但均無法有效預(yù)防復(fù)發(fā)、死亡等的發(fā)生，患者的整體預(yù)后狀況仍不容樂觀[1-3]。在腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤疾病中，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是影響其治療效果和預(yù)后的重要因素[4-5]。因此，對腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的干預(yù)有助于其療效和預(yù)后的改善。長鏈非編碼RNA（lncRNA）指的是長度大于200 bp 且無蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 鏈，且已有研究證實lncRNA在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中均具有重要影響[6-7]。本研究亦關(guān)注腦膠質(zhì)瘤lncRNA，分析敲低lncRNA DILC 對膠質(zhì)瘤細胞體外生物學(xué)特性的影響，旨在為膠質(zhì)瘤早期診治提供可能新策略，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質(zhì)瘤細胞系LN382、U87MG 購自中科院上海生命科學(xué)院研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，相關(guān)儀器如下：SW-CY-1F型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Forman Scientific 公司）、離心機（德國Eppendorf 公司）、顯微鏡（日本Nikon 公司）、離心管、玻璃瓶、吸管、試管等（江蘇佳美儀器有限公司）、低溫冰箱（日本Sanyo公司）、PCR 基因擴增儀（美國BIORAD 公司）、電泳儀（北京六一儀器廠）、酶標(biāo)儀（美國BIORAD 公司）、顯微圖像分析系統(tǒng)（美國Image 公司）相關(guān)試劑如下：Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen 公司）、RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco 公司）、RNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega 公司）、實時定量PCR 試劑盒和SYBR Premix EX Taq（日本Takara 公司）、ddH2O（上海索寶生物科技有限公司）、胰蛋白酶（上海江萊生物科技有限公司）、JAK、STAT3、p-JAK2、p-STAT3 BCA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）、多聚甲醛（武漢西祺生物科技有限公司）、結(jié)晶紫（北京酷來搏科技有限公司）、IL-6、p-JAK2、p-STAT3 PCR 擴增引物序列（上海生物工程公司）、人IL-6 ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）、Lnc RNA DILC siRNA、negative siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和處理

膠質(zhì)瘤細胞系LN382、U87MG 均培養(yǎng)在含15%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)進行消化傳代，并取對數(shù)生長期細胞進行相關(guān)實驗研究。

膠質(zhì)瘤細胞系LN382、U87MG 分別分組為NC組和敲低組。取各組對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板中，細胞增長至70%融合時，通過Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染，其中NC組均以negative siRNA 轉(zhuǎn)染，敲低組則以LncRNA DILC siRNA 轉(zhuǎn)染，LncRNA DILC siRNA 序列為5′-AAGUGGAAGCGCAACAGGAAA-3′，而此序列打亂且并經(jīng)分析不干擾任何基因表達的序列（5′-GAUAAAGGAAGGCAAGGACAC - 3′）則為negative siRNA。

1.2.2 PCR檢測

轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48 h，PCR檢測IL-6、JAK2、STAT3 表達水平，細胞充分裂解提取總RNA，取2 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。各引物序列（見表1）。PCR 反應(yīng)體系：上游引物1 μg、下游引物1 μg、2×ES Reaction Mix 10 μL、d T18 1 μL、RIES Mix 1 μL，并補水至20 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：94℃5 min，94℃30 s、64℃30 s、72℃45 s，共33個循環(huán)后72℃延伸10 min。將獲取的擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)掃描，采用2-△△CT法進行各目標(biāo)基因的mRNA 相對表達量分析。

1.2.3 ELISA 法檢測

轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48 h，ELISA 法檢測離心細胞上清液中IL-6 水平，收集細胞上清液，1 600 r/min 轉(zhuǎn)速、3 cm 半徑離心5 min，分層后收取上清，根據(jù)人IL-6 ELISA 試劑盒以及酶標(biāo)儀步驟指導(dǎo)進行IL-6 水平的檢測。

表1 引物序列表Table1 primer sequence table

1.2.4 Western Blot 法檢測

轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48 h，Western Blot 法檢測JAK2、STAT3、p-JAK2 及p-STAT3 蛋白質(zhì)表達水平，取待檢測樣本離心漂洗進行細胞裂解，再次離心處理后取上清液5 μL，通過BCA 法檢測JAK2、STAT3、p-JAK2 及p-STAT3 蛋白濃度，具體的檢測操作嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。通過同一泳道條帶灰度值的比值反應(yīng)蛋白表達水平，計算p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3。

1.2.5 Transwell 小室侵襲實驗

細胞轉(zhuǎn)染后48 h，Transwell 小室侵襲實驗[8]觀察細胞的侵襲能力。

1.2.6 劃痕實驗細胞轉(zhuǎn)染后48 h，Transwell 小室遷移劃痕實驗[9]觀察細胞的轉(zhuǎn)移能力狀況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行分析，計量資料比較均符合正態(tài)分布，以（）表示，組建比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力比較

細胞轉(zhuǎn)染后48 h，與LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞的NC組比較，其相應(yīng)敲低組的穿膜細胞數(shù)增加，細胞遷移距離亦增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1和圖2。

表2 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力比較（±s）Table2 Comparison of invasion and metastasis ability of ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

表2 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力比較（±s）Table2 Comparison of invasion and metastasis ability of ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

注：與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.05。

組別敲低組NC組LN382 Transwell穿膜細胞數(shù)（個）216.45±14.32a 96.75±12.43細胞遷移距離（mm）0.92±0.15a 0.66±0.13 U87MG Transwell穿膜細胞數(shù)（個）231.44±19.75b 95.68±15.62細胞遷移距離（mm）0.89±0.11b 0.68±0.09

圖1 各組侵襲實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×400）Figure1 Results of invasion experiment in each groups（結(jié)晶紫染色，×400）

2.2 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞IL-6、JAK2、STAT3的mRNA相對表達量比較

與LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞的NC組比較，其相應(yīng)敲低組的IL-6、JAK2、STAT3的mRNA 相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞各組IL-6、JAK2、STAT3 蛋白質(zhì)表達水平比較

細胞上清液中IL-6 水平升高，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3 蛋白質(zhì)表達水平亦相應(yīng)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

圖2 各組遷移實驗結(jié)果Figure2 Results of migration experiment in each groups

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤，為常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病之一，其發(fā)生率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，是目前研究熱門腫瘤疾病之一。腦膠質(zhì)瘤疾病的臨床治療方案中以手術(shù)切除治療為主，術(shù)后常輔以放化療等輔助治療，但這樣的治療方案雖然一直在不斷優(yōu)化改進，大部分惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后狀況仍較差[10-11]。多數(shù)惡性腫瘤具有較強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，鄰近組織侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移可加重其治療的困難程度，進而影響療效和預(yù)后狀況[12-13]。

近年來的研究表明，多個lncRNA的異常表達狀況與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及疾病復(fù)發(fā)等預(yù)后狀況密切相關(guān)[14]。如陶海云等人[15]的研究中，LINC00152與腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，而抑制LINC00152 表達可達到抑制腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的效果。鄭杰靈等人[16]的研究亦表明Lnc RNA TCONS_00008552 在膠質(zhì)瘤放療抵抗株中的表達水平較高，在腦膠質(zhì)瘤細胞放療抵抗中具有促進作用，且在腦膠質(zhì)侵襲轉(zhuǎn)移中亦具有促進作用。lncRNA DILC 亦是與惡性腫瘤密切相關(guān)lncRNA 之一，其在肝癌中的表達出現(xiàn)明顯下調(diào)，可抑制肝癌干細胞擴增[17]。本研究亦關(guān)注腦膠質(zhì)瘤lncRNA DILC 在膠質(zhì)瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性中的作用，并分析了其可能作用機制，可為通過lncRNA DILC 檢測干預(yù)達到膠質(zhì)瘤早期診治，從而改善療效和預(yù)后提供依據(jù)。

表3 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞IL-6、JAK2、STAT3的mRNA相對表達量比較（±s）Table3 Comparison of relative mRNA expression of IL-6，jak2 and STAT3 in ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

表3 各組LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞IL-6、JAK2、STAT3的mRNA相對表達量比較（±s）Table3 Comparison of relative mRNA expression of IL-6，jak2 and STAT3 in ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

注：與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.05。

組別敲低組NC組LN382 IL-6 0.568±0.144a 0.344±0.035 JAK2 0.612±0.102a 0.308±0.068 STAT3 0.455±0.087a 0.241±0.025 U87MG IL-6 0.528±0.071b 0.327±0.035 JAK2 0.587±0.088b 0.319±0.024 STAT3 0.483±0.069b 0.266±0.043

表4 LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞各組IL-6、JAK2、STAT3 蛋白質(zhì)表達水平比較（±s）Table4 Comparison of protein expression levels of IL-6，JAK2 and STAT3 in ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

表4 LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞各組IL-6、JAK2、STAT3 蛋白質(zhì)表達水平比較（±s）Table4 Comparison of protein expression levels of IL-6，JAK2 and STAT3 in ln382 and U87MG glioma cells in each groups（±s）

注：與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.05。

組別敲低組NC組LN382 IL-6（ng/L）85.66±6.64a 27.51±5.75 p-JAK2/JAK2 0.462±0.009a 0.263±0.016 p-STAT3/STAT3 0.626±0.112a 0.215±0.035 U87MG IL-6（ng/L）82.16±8.13b 23.58±5.29 p-JAK2/JAK2 0.431±0.024b 0.255±0.007 p-STAT3/STAT3 0.651±0.082b 0.223±0.047

本研究結(jié)果提示lncRNA DILC與LN382、U87MG 膠質(zhì)瘤細胞體外侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性相關(guān)，而其表達抑制可能促進腦膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而提高其表可能有助于腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移干預(yù)。本研究中，結(jié)果提示IL-6/JAK2/STAT3 信號通路可能為lncRNA DILC 影響腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要信號通路，具體可能為lncRNA DILC 低表達可能促進IL-6/JAK2/STAT3 信號通路活化，從而促進血管內(nèi)皮生長因子表達，抑制膠質(zhì)纖維酸性蛋白轉(zhuǎn)錄，影響星形膠質(zhì)細胞提供細胞骨架穩(wěn)定性，從而促進腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移。

綜上所述，lncRNA DILC與膠質(zhì)瘤密切相關(guān)，敲低lncRNA DILC 可激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3 信號通路，促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因此，對lncRNA DILC 及其相關(guān)信號通路IL-6/JAK2/STAT3 信號通路干預(yù)可能為腦膠質(zhì)瘤有效干預(yù)途徑。