β溶血表型摩根摩根菌的鑒定及系統發育樹構建

賈琴妹 滿寶華

摩根摩根菌（Morganella morganii，M.morganii）是腸桿菌科摩根菌屬（Morganella）的唯一菌種，常寄生于人和動物的腸道，為人體腸道正常菌群的重要成員之一，廣泛分布于自然界及醫院環境中，屬條件致病菌。其主要引起泌尿道感染和傷口感染，其他部位感染少見[1]，但近幾年國內外均有文獻報道其引起菌血癥、腦膜炎、關節炎、心包炎和眼內膜炎等[2-3]。摩根摩根菌的生物學特性是兼性厭氧，對營養要求不高，在營養瓊脂和血瓊脂上均可生長，約有50%的菌株在血瓊脂上產生α溶血[4]。本文將報道一株從中段尿中分離培養及鑒定出的β溶血摩根摩根菌，以及基于16S rDNA的系統發育樹構建，從而提高擴充醫務人員對β溶血摩根摩根菌的認識，及時有效地為感染者診治。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

分離出的摩根摩根菌（標本編號：U1901）源于云南省第三人民醫院重癥醫學科（Intensive Care Unit，ICU）某患者中段尿培養。質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和摩根摩根菌（ATCC 25830）均購自國家衛健委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀及配套鑒定卡、VITEK MS-DS 靶板和VITEK MSCHCA 基質液均購自法國梅里埃公司；CO2培養箱為美國Thermo 公司產品；旋渦混合器VDRTEX-5購自海門其林貝爾儀器制造有限公司；細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 擴增儀購自美國PE 公司；電泳儀購自美國Tanon 公司；紫外凝膠成像儀購自上海復日生物技術有限公司。

1.3 菌株的分離培養和連續傳代培養

無菌操作采集送檢的中段尿樣本，接種于血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板（鄭州安圖生物有限公司產品），置5% CO2溫箱35℃～37℃孵育18～24 h；同樣的培養環境，將菌株連續傳代培養10次，觀察溶血現象。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀鑒定

挑取分離出的純菌落與鹽水充分混勻，菌懸液濃度調至（0.5～0.63）麥氏單位；將配套的GN 鑒定卡插入菌懸液中，再轉移到鑒定儀中進行掃描上機處理；上機所得的生化反應結果與鑒定儀中高級專家系統（Advanced Expert System，AES）數據庫進行比對分析，最終得出鑒定結果。

1.4.2 機制輔助激光解析離子-飛行時間質譜儀（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionozation-time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）鑒定

選取分離培養后的純菌落均勻涂布在質譜儀器特有的96 孔鋼板上；而后在涂布細菌的孔上加入1 μL 基質液；待其干燥后放入質譜儀器進行檢測，最后將所得的質譜峰圖與數據庫中峰圖進行比較，得出鑒定結果。

1.5 16S rDNA測序及同源性分析

首先采用細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取菌株DNA 模板，操作嚴格按照試劑盒說明書操作。PCR 擴增引物[5]分別為：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，PCR 反應體系（50 μL）如下：40.2 μL ddH2O，2 μL 基因組DNA（15 ng/μL）作為模板；0.5 μL 的dNTP（10 mM），5 μL 的10×TaqPCR緩沖液（Mg2+），每條引物（10 pmol/μL）1 μL，0.3 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸50 s、35個循環；72℃補延伸10 min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，同時觀察條帶大小，并挑取陽性產物回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。最后將測序的結果從NCBI 網站“blast”GenBank 數據庫檢出與所測菌株16S rDNA 序列同源性較高的序列，判斷16S rDNA 基因鑒定結果，同時驗證VITEK-2 Compact和MALDI-TOF-MS鑒定結果的正確性。

1.6 系統發育分析

使用Blast 將基因預測得到的16S rDNA 序列與NCBI的16S數據庫進行比對，設置參數identify＞95。然后選取identify最高的前30條16S rDNA 序列（不足則全取），并利用Muscle（Multiple Protein Sequence Alignment）軟件進行序列多重比對后，采用FastTree 軟件構建菌株的系統發育樹。

1.7 溶血素（Hemolysin）基因檢測

采用細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取的DNA 作為模板，根據文獻[6]報道合成PCR 引物，包括HlyA、HlyB、HlyC、HlyD引物序列引物序列見表1，PCR反應體系（10 μL）如下：3.2 μL ddH2O，1 μL 基因組DNA（30 ng/μL）作為模板；0.5 μL 的dNTP（10 mM），4 μL 的10×TaqPCR 緩沖液（Mg2+），每條引物（10 pmol/μL）1 μL，0.3 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）。PCR 擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min、60℃退火1 min、72℃延伸40 s、共進行40個循環。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，陽性產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 編碼溶血素基因引物序列Table1 Primer sequence of hemolysin gene

2 結果

2.1 分離培養情況

血瓊脂平板培養基上可觀察到單個、中等大小、濕潤的灰白色菌落，邊緣整齊，無特殊氣味，但菌落周圍有β溶血環；連續10次傳代后，β溶血現象穩定存在，見圖1。

圖1 細菌在血平板表型特征Figure1 The phenotypic characteristics of bacteria on the blood plate

2.2 VITEK-2 Compact和MALDI-TOF-MS鑒定結果

VITEK-2 Compact 鑒定結果：奇異變形桿菌，可信度99%，見圖2。

MALDI-TOF-MS 鑒定結果：摩根摩根菌，可信度99.9%，見圖3。

2.3 16S rDNA 測序結果

將菌株測序后獲得的序列在GenBank 數據庫中進行比對，結果顯示與摩根摩根菌摩根亞NBRC 3848 同源性最高，達到99.99%。

圖2 質控菌株摩根摩根菌及奇異變形桿菌的GN 鑒定圖Figure2 The GN identification results of quality control strain M.morganii and Proteus mirabilis

圖3 摩根摩根菌質譜圖Figure3 The mass spectrogram of M.morganii

2.4 16S rDNA 測序驗證對比

VITEK-2 Compact 鑒定結果（奇異變形桿菌）和MALDI-TOF-MS 鑒定結果（摩根摩根菌）不一致，16SrDNA 測序方法驗證結果為摩根摩根菌摩根亞種NBRC 3848。

2.5 基于16S rDNA的同源性分析和系統發育樹

使用Blast 將菌株（標本編號：U1901）的16SrDNA 序列與NCBI 的16S 數據庫進行比對后發現在該系統發育樹上可見，U1901與摩根摩根菌摩根亞種NBRC 3848 形成一個分支，驗證可信度達99.99%。見圖4。

圖4 基于16S rDNA的系統發育樹Figure4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.6 溶血素（Hemolysin，Hly）基因檢測結果

通過對HlyA、HlyB、HlyC、HlyD基因的擴增，HlyB為陽性，其余均為陰性。測序結果顯示檢出的HlyB與病原菌毒力因子（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）數據庫中HlyB有99%同源性。

3 討論

近幾年，隨著社會環境和醫療技術水平的逐漸改變，摩根摩根菌的感染部位和檢出率在不斷增加[7]。由ICU 患者所處的情況可知，本研究中的摩根摩根菌是在眾多因素作用壓力下存活繁殖，其毒力和耐藥率較高。該菌在血瓊脂平板上出現典型的β溶血環，隨后檢測到溶血素（HlyB）基因。與傳統摩根摩根菌相比較[4]，此菌具有β溶血現象特征，是摩根摩根菌家族中新增的一個表型。至今為止，可能由于該表型的摩根摩根菌出現較少而未被發現等原因，未查閱到與此表型相關的國內外文獻報道。本實驗中摩根摩根菌HlyB基因的獲得可能是由混合感染的細菌（如：大腸埃希菌O157：H7）間經接合、轉導、插入等方式傳播而來。溶血素的產生，增強了細菌的致病性。

VITEK-2 Compact 鑒定結果出來后，檢查排除了儀器設備、配套使用的材料、操作等無任何問題；也查看分析了細菌無污染情況。隨后重復操作多次，鑒定結果均與首次一致。原因可能是VITEK-2 Compact 儀器自身存在局限性（如：AES數據庫未更新），也可能是由于菌株的生理生化反應發生了一點偏差，最終均影響鑒定結果的準確性。奇異變形桿菌和摩根摩根菌以前同屬腸桿菌科變形桿菌族細菌，后來才成為獨立菌屬細菌，因此大部分生化反應相同，主要的鑒別試驗是硫化氫、鳥氨酸脫羧酶和枸櫞酸鹽試驗[4]，這3個試驗中若某個發生一點偏差，均會顯示不同的鑒定結果，這可能就是VITEK-2 Compact 鑒定結果不準確的原因所在。但是，目前很多文獻都有報道[7-9]VITEK-2 Compact 對傳統經典的摩根摩根菌鑒定結果均準確，本實驗室也是如此。本研究中MALDI-TOF-MS 方法對β溶血的摩根摩根菌能快速準確完成鑒定。其主要原因是MALDI-TOFMS 技術能直接分析完整的蛋白質分子避免了生化反應結果的偏差及所需的反應時間，彌補了傳統的生理生化反應鑒定方法的不足之處。有文獻報道[10]，其與全自動微生物鑒定儀的生化反應相比，MALDI-TOF-MS 已經逐步成為一種新型的微生物檢測和鑒定技術，并且以其快速、準確、靈敏、高效、低成本、易操作等優勢得到快速發展。目前，國內外臨床微生物實驗室逐漸重視MALDITOF-MS 在微生物領域的應用[11-12]。

16S rDNA 基因序列具有較高保守性、突變率小，分子量大小適中等優點，屬于原核生物核糖體小亞基，存在于所有細菌染色體基因組中[13]。序列包含11個恒定區和與之相間的10個可變區。保守區為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異[14]，可變區因細菌菌種不同而存在差異，因此利用可變區序列的這種差異來對不同種屬的細菌進行分類鑒定已被認同且廣泛應用。且國際上已逐步認同用原核生物的16S rDNA 序列作為原核生物分類鑒定的標準[15-16]，也是驗證其它方法結果的標準，其能準確將未知菌鑒定到種，甚至亞種水平。本文中，16S rDNA 系列測序結果驗證了MALDI-TOF-MS 方法能準確鑒定出細菌菌種。

摩根摩根菌雖不是臨床常見病原菌，但引起的感染發生率在逐年增加[17]，且對抗菌藥物耐藥率也在增加。本研究中的摩根摩根菌產溶血素，增加了其致病性。因此，應引起臨床醫生和微生物檢測人員的高度重視，不斷提高補充自身知識庫，及時對儀器專家數據庫進行更新升級，加強醫務人員之間有效的溝通，正確合理使用抗菌藥物，嚴格執行消毒隔離措施，減少耐藥基因和毒力因子的出現及傳播擴散。