TB-DNA和IGRAs對川西高原地區肺結核診斷的適用性分析

茍甜甜 向章朋 柳夢君 李隆勇 周衛東

結核病以肺結核為主，是嚴重危害人民群眾身體健康的重大傳染病之一，目前我國仍是全球30個結核病高負擔國家之一，每年新發結核病患者約90萬例，位居全球第3位。結核病發病人數仍然較多，中西部地區、農村地區結核病防治形式嚴峻[1]。最新實施的肺結核診斷（WS 288-2017）[2]在2008版基礎上增加了γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assays，IGRAs）和分子生物學檢查，為肺結核的早期診斷提供了幫助，但肺結核發病存在明顯的地區差異和空間聚集性，且川西高原地區是肺結核的好發區域[3]，這兩項檢查對該地區肺結核診斷價值是否與其他地區一致，尚未見相關報道，為此本研究對來自川西高原地區的510例肺結核疑似病例進行了研究，以期為肺結核的早期診斷提供指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年4月至2019年5月在本院住院的肺結核疑似患者510例，平均年齡（48.5±18.8）歲。入選標準：長期居住地為川西高原地區，斷層掃描（Computed Tomography，CT）檢查提示肺部感染，住院期間檢測了γ-干擾素釋放試驗和結核分枝桿菌（M.tuberculosis，TB）DNA 試驗。肺結核臨床診斷標準[2]：有典型肺結核臨床癥狀和胸部X 線或CT 表現，抗結核治療有效，或結核涂片或培養陽性。根據臨床診斷作為“金標準”，將研究人群分為肺結核組和非肺結核組。肺結核組154例，平均年齡（39.6±18.4）歲，其中結核性胸膜炎51例，氣管、支氣管結核2例，繼發性肺結核（包含并發胸腔積液）101例；非肺結核組356例，年齡（52.3±17.7）歲，主要以細菌性肺炎、真菌性肺炎和慢性阻塞性肺炎為主。

1.2 儀器和試劑

儀器采用美國應用生物系統公司Applied Biosystems ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀和艾德康生物的ADC ELII SA400 全自動酶免分析儀，試劑使用中山大學達安基因股份有限公司的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒和北京萬泰生物藥業股份有限公司的γ-干擾素釋放試驗檢測試劑盒。

1.3 標本采集及處理

血液標本用美國BD 公司的肝素鈉抗凝真空管采集5 mL 靜脈血。痰液囑患者漱口后咳深部痰液，肺泡灌洗液由行纖維支氣管鏡檢查時采集，胸水由專業醫生采集，標本采集后，1 h 內送檢。痰液和肺泡灌洗液經4% NaOH 液化后使用，胸水低速離心富集沉淀。

1.4 TB-DNA 檢測及結果判定

經處理后的標本，按照試劑說明書提取核酸，加5 μL 到反應管，8 000 r 瞬離數秒，設置擴增程序后，上機擴增，每批實驗均帶有陰性和陽性對照。病人痰液、肺泡灌洗液或胸水中任一個TB-DNA 結果為陽性即判定為該患者TB-DNA陽性。

1.5 γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）

血液采集后，1 h 內混勻分裝到檢測管、陰性和陽性結核感染T細胞培養管中，孵育24 h，通過結核分枝桿菌特異性重組抗原刺激感染者的特異性T 淋巴細胞，并使其增殖、釋放γ-干擾素（interferon，IFN-γ），然后用ELISA 法檢測IFN-γ。

1.6 統計學處理

應用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，計數資料采用n（%）表示，計量資料用（）表示，組間顯著性檢驗比較用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TB-DNA和IGRAs 在肺結核中的診斷價值

按照“金標準”，將研究人群分為肺結核組和非肺結核組，分別統計TB-DNA和IGRAs 兩種診斷方法的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，結果見表1。

表1 TB-DNA和IGRAs 在肺結核中的診斷價值Table1 Diagnostic value of TB-DNA and IGRAs in pulmonary tuberculosis

2.2 TB-DNA和IGRAs 在不同類型肺結核中的陽性率

將肺結核患者分為結核性胸膜炎和繼發性肺結核，分別分析TB-DNA、IGRAs 以及兩者聯合在這兩種類型肺結核中的陽性率，3種檢測方法在繼發性肺結核中的陽性率均高于結核性胸膜炎，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 TB-DNA和IGRAs 在結核性胸膜炎和繼發性肺結核中的陽性率比較[n（%）]Table2 Comparison of positive rates of TB-DNA and IGRAs in tuberculous pleurisy and secondary tuberculosis[n（%）]

2.3 肺結核患者不同標本類型的TB-DNA 檢測陽性率

肺結核患者不同標本類型的TB-DNA 陽性率不同，肺泡灌洗液最高，其次為自然咳痰，胸水最低，3種標本之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 肺結核患者不同標本類型的TB-DNA 陽性率[n（%）]Table3 Positive Rate of TB-DNA in Different Specimens of Tuberculosis Patients[n（%）]

2.4 不同標本類型TB-DNA與IGRAs 結果一致性分析

在非肺結核患者和肺結核患者中，肺泡灌洗液、自然咳痰和胸水的TB-DNA的檢測結果與IGRAs 結果不一致。見表4。

表4 不同標本類型TB-DNA與IGRAs 一致性Table4 Consistency of TB-DNA in different specimen types and IGRAs

3 討論

四川西部地區屬于高海拔地區，公共衛生條件較差，肺結核是當地常見的傳染性疾病之一，但因肺結核臨床癥狀不明顯，涂陰肺結核所占比例越來越大[4]，傳統的實驗室檢查如結核抗體、結核菌素試驗、抗酸染色等，靈敏度和特異性低，結核培養周期太長等原因，造成肺結核早期診斷困難，往往被誤診為細菌性肺炎，造成抗生素濫用，延誤疾病的治療和愈合，增加國家和病人的負擔。

近年來，大量的文獻報道，TB-DNA在肺結核診斷中有非常重要的價值，唐婧等[5]人的報道顯示肺泡灌洗液TB-DNA的靈敏度為80.3%，特異性為97.7%，李春梅等[6]人報道肺泡灌洗液TB-DNA在肺結核中的診斷靈敏度高于TB 培養法。也有一些文獻報道的數據與之差異較大，如周前選等[7]報道TB-DNA 對肺結核診斷的靈敏度為54.8%，秦慶等[8]人的研究結果顯示靈敏度僅有38.54%，這可能與標本類型的選擇有關。因此，TB-DNA 對鑒別是否為肺結核有較為重要的意義，但不適宜用于肺結核的篩查，尤其是結核性胸膜炎，這樣可能會造成肺結核的漏診。

國內外關于IGRAs 的一些研究[9-11]顯示，IGRAs對肺結核的診斷靈敏度有較大優勢。但IGRAs 要受病人免疫功能影響，同時也不能區分陳舊性肺結核和活動性肺結核，而川西高原地區肺結核形勢嚴峻，陳舊性肺結核較為常見，造成該方法對該地區肺結核的診斷特異性較差，僅為70.2%，該數據低于傅志輝等[11]報道的82.1%，所以IGRAs 不適宜單獨用于川西高原地區肺結核的診斷，這樣可能會造成肺結核的誤診。

根據TB-DNA和IGRAs 的優缺點，若將二者聯合，可將結核性胸膜炎和繼發性肺結核的檢出率提高到70.6%和95.0%，減少臨床肺結核的漏診和誤診。同時我們還發現TB-DNA在不同類型標本中檢出率不同，以肺泡灌洗液陽性率最高（66.0%），與李振聲等[12]報道的62.77%接近，略低于唐婧等人的研究結果（80.3%）。但肺泡灌洗液需用纖支鏡才能采集，采集過程較為痛苦，部分患者不能接受，另外我們也在105例非肺結核患者肺泡灌洗液中檢測到了6例陽性（CT 均在20 以上），我們認為是陳舊性結核引起的，所以建議有條件者最好送檢肺泡灌洗液。我們的研究中發現有3例肺結核患者是通過多次送檢痰液TB-DNA 檢查出來的，對于不能進行纖支鏡檢查的病人，建議可多次送檢深部痰液，以提高檢出率。陽性率最低的是胸水（11.1%），對結核性胸膜炎的診斷價值非常有限，周華等[13]建議結合胸水ADA，可提高診斷準確性。

當同一患者出現TB-DNA與IGRAs 結果不一致時，臨床醫生常常感到疑惑，我們就兩者一致性進行了分析。在非肺結核組中，肺泡灌洗液、自然咳痰和胸水TB-DNA與IGRAs 陰性符合率較高，因此我們認為IGRAs 用于排除肺結核感染有一定優勢。在非肺結核組中，除了肺泡灌洗液TB-DNA檢測出了2例弱陽性，其余標本TB-DNA 均未檢測出陽性例數，但IGRAs 檢測出了106例陽性，我們認為兩者不一致的主要原因可能是IGRAs 不能區分陳舊性肺結核，造成部分IGRAs 結果為假陽性。因此，當兩者出現結果不一致時，應綜合分析，并結合其他檢測手段綜合判斷。

對于肺結核診斷方法和技術仍處于不斷發展和完善的過程中，臨床實際工作中仍需要診斷價值更高的實驗室檢查項目，尤其是還缺乏肺結核治療效果監測的指標，不過已有部分文獻[14-15]報道TB-RNA在診斷肺結核方面有更加高的靈敏度，也有部分學者[16-17]報道血液中外泌體miRNA與活動性肺結核有關，有望成為新的肺結核血清標志物。

TB-DNA和IGRAs 單獨用于川西高原地區肺結核的診斷均不夠靈敏，選擇合適的標本和運用聯合檢測可以提高肺結核的檢出率，有利于川西高原地區肺結核的早期診斷。