地中海貧血基因檢測試劑盒抽驗質量分析

張文新 于婷 孫楠 高飛 黃杰 曲守方

地中海貧血（簡稱地貧）是最常見的一種常染色體單基因遺傳病，它是由于人體珠蛋白基因突變或缺失，導致珠蛋白肽鏈生成障礙而引起一種或幾種珠蛋白肽鏈生物合成不足或完全缺乏，從而引發的一種遺傳性溶血性貧血[1]。根據缺陷的珠蛋白類型，地貧可分為α、β、δ、γ 等幾種類型，其中α-地貧和β-地貧是最常見的地貧類型。α-地貧（α-thalassemia）是一種由于α 珠蛋白鏈的合成減少或者缺失所導致的常染色體隱性遺傳疾病。大多數的α-地貧是由于α 珠蛋白基因的缺失所致，少數由基因點突變造成，常見類型有SEA、α3.7、α4.2、Constant Spring（Hb CS）和Hb Quong Sze（Hb QS）等[2-3]。β-地貧（β- thalassaemias）是一種由于β 珠蛋白合成異常所導致的常染色體隱性遺傳性疾病。β-地貧最常見的突變類型是β-珠蛋白基因點突變，少數為基因缺失，常見類型為CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、CD71-72等[4-5]。在我國常見于廣東、廣西、福建、海南、貴州、云南、四川、香港、臺灣等地區，其中兩廣地區（廣東和廣西）乃地貧高發區。國家藥品監督管理局批準的地中海貧血基因檢測試劑盒，包括PCR-反向點雜交法[6]、熒光PCR 熔解曲線法[7]、PCR-導流雜交法[8]、裂口PCR 法（Gap-PCR）[9]、PCR-流式熒光雜交法[10]、PCR-熒光探針法和微陣列芯片法[11]等。地中海貧血基因檢測試劑盒屬于三類體外診斷試劑，漏檢、假陽性、交叉反應、檢測限不合理、適用樣本類型不明確及缺少內控為該類試劑的最大的風險點。因此按照國家醫療器械抽驗項目計劃，對抽樣的6家企業18 批次地中海貧血基因檢測試劑盒進行監督檢測和質量情況評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抽樣試劑盒及國家參考品

各省（區、市）食品藥品監管部門結合體外診斷試劑國家監督抽驗工作統籌安排，在規定期限內完成抽樣、樣品寄送和信息錄入等工作。本次抽驗共收到18個批次地中海貧血基因檢測試劑盒，在生產環節（含進口總代理單位）抽到樣品14批次，在使用環節抽到樣品4 批次，涉及6家生產企業。地中海貧血核酸檢測國家參考品（批次：360014-201701），由中國食品藥品檢定研究院提供。抽驗產品的相關信息，見表1。

表1 抽樣試劑盒Table1 Sampling kits

1.1.2 儀器

醫用核酸分子雜交儀（廠家及型號：廣州凱普，HB-2012A）、恒溫雜交儀（廠家及型號：深圳亞能，YN-H16）、全自動醫用PCR 分析系統（廠家及型號：上海宏石，SLAN-96S）、實時熒光定量PCR擴增儀（廠家及型號：美國Bio-Rad，CFX96）、液相芯片懸浮檢測儀（廠家及型號：美國Luminex，MAGPIX）、凝膠成像系統（廠家及型號：美國Bio-Rad，Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 法定檢驗

按照企業注冊產品標準/產品技術要求檢驗采用各企業提供參考品，分別檢測對應抽檢的檢測試劑盒，檢驗項目包括準確性（陽性參考品符合率）、特異性（陰性參考品符合率）、檢測限和重復性。按照各企業試劑盒說明書的操作步驟進行檢測，最后對實驗結果進行判定。為了驗證抽驗試劑盒的有效性，要求從生產環節和使用環節抽取相同批號的試劑進行測定。

1.2.2 探索性研究

YY/T 1527-2017《α/β-地中海貧血基因分型檢測試劑盒》行業標準于2018年4月1日正式實施。地中海貧血核酸檢測國家參考品（批次：360014-201701），包括32 份樣本，均為基因組DNA，由臨床樣本建立的永生化細胞系提取獲得，其中有3 份正常樣本，其余29 份全部為地中海貧血基因突變的樣本，涉及到9種α-地中海貧血基因突變類型和20種β-地中海貧血基因突變類型。依據行業標準，采用國家參考品，針對準確性、特異性、檢測限3個項目開展探索性研究。

2 結果

2.1 法定檢驗結果

本次抽檢共抽到18 批次的地中海貧血基因檢測試劑盒，使用企業參考品，按照各自的企業注冊產品標準/產品技術要求進行檢測，合格產品數量為18 批次，占比為100%；不合格產品數量為0 批次。

以缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（Gap-PCR法）為例，結果表明P1、PL1和R1 均為αα/-α3.7型別，P2和PL2 均為αα/-α4.2型別，P3和PL3 均為αα/--THAI型別，P4 、PL4和R2 均為-α4.2/--SEA型別，N1- N4 均為αα/αα型別；均符合相應的基因型別，見圖1。

2.2 探索性研究結果

圖1 企業參考品實驗結果Figure1 The results of the en terprise refererce

18個批次的試劑盒均符合行業標準中準確性和特異性規定；但是有1個批次產品的檢測限設置為20 ng/μL（說明書規定的樣本上樣量為3 μL 或6 μL），不符合行業標準中“檢測限：不高于25 ng或4 000 拷貝”，不適用于探索性研究的實驗設計，而其它17個批次的試劑盒均符合行業標準中檢測限規定。以缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（Gap-PCR法）為例，結果表明使用試劑盒檢測范圍內的國家陽性參考品進行檢測，同時將這些參考品DNA 稀釋至企業聲稱的2 ng/μL 檢測限濃度進行檢測，也都檢出相應的基因型別，符合國家參考品的要求，即G5、G6、G30 均為αα/--SEA，G7為-α3.7/--SEA，G8為αα/-α3.7，G19為αα/-α4.2，G29為-α4.2/-α4.2，G32為αα/--THAI，見圖2。另外對試劑盒檢測范圍外的國家陽性參考品和國家陰性參考品進行檢測，均為αα/αα，沒有交叉反應，符合國家參考品特異性要求，見圖3和圖4。

圖2 國家參考品準確性和檢測限實驗結果Figure2 The results of the national reference for accuracy and detection limit

3 討論

圖3 國家參考品特異性實驗結果Figure3 The results of the national reference for specificity

圖4 國家參考品特異性實驗結果Figure4 The results of the national reference for specificity

本次監督抽驗工作是根據地中海貧血基因檢測試劑盒的抽驗方案，按照企業的注冊產品標準或者技術要求，使用企業參考品或國家參考品進行檢驗，并出具檢測報告。但是由于缺乏統一的評判標準，并不能對抽驗的試劑盒質量做出客觀的評價。目前國內現行有效的行業標準是YY/T 1527-2017《α/β-地中海貧血基因分型檢測試劑盒》，該標準于2017年3月28日發布，于2018年4月1日正式實施，屬于推薦性行業標準。中國食品藥品檢定研究院在2017年發布了地中海貧血核酸檢測國家參考品。在該標準實施之前申報的試劑盒，均按照各企業制定的注冊產品標準或者技術要求為依據進行檢驗，因此檢測指標差異較大，試劑盒的質量參差不齊。而且注冊申報的企業均采用自制參考品進行檢測，其真實有效性無法保障。所以在監督抽驗的探索性研究中，同時按照行業標準的要求和采用國家參考品檢驗，作為統一的尺度，用于評價不同試劑盒的質量[12]。

通過監督抽驗工作，發現部分企業的產品標準或產品技術要求中的技術指標未按照行業標準的要求進行設置，有缺項或者內容不全的情況，例如未設置檢測限項目，特異性項目中未設置對試劑盒檢測范圍外相應型別樣本的檢測；也發現部分企業的產品標準或產品技術要求中的技術指標低于行業標準的要求，例如重復性項目中重復檢測的次數少于行業標準要求的次數，檢測限項目檢測的樣本量高于行業標準要求的25 ng 或4 000拷貝。因為行業標準是最低的要求，建議企業應加強與實施的行業標準的一致性，而且應不低于行業標準的要求[13]；同時建議標準管理部門應加強對實施的行業標準的宣貫工作。

另外發現部分企業的自制參考品全部為質粒或部分為質粒，并未采用臨床樣本或臨床樣本提取的基因組DNA，因此不能反映臨床真實樣本的結果，也無法正確評估試劑盒的臨床適用性。在檢測地中海貧血檢測試劑盒（PCR-導流雜交法）時，發現企業在技術要求和說明書的結果判定中均沒有給出質粒參考品的結果示意圖，導致對于質粒來源的企業陽性參考品無法進行判讀，需要企業另外提供補充資料才能進行結果判讀。抽驗中還發現企業提供的說明書存在著其它很多問題：①首先企業說明書中沒有提供試劑盒檢測范圍內的所有類型的結果示意圖，對純合突變或復合突變的部分國家參考品和企業參考品無法進行判讀；②某些產品在后期產品注冊審批的過程中，有些突變位點并未獲得批準，這些突變位點并不在試劑盒說明書預期用途的檢測范圍內，但試劑盒本身具備檢測相應突變的能力。這些突變的參考品均需要企業另外提供補充資料才能進行判讀，使檢測人員在監督抽驗和注冊檢測中缺乏可操作性。

本次監督抽驗涉及的抽樣企業數量不多，涉及6家生產企業（覆蓋率為60%）的14個試劑盒（覆蓋率為48%），建議今后應加大抽驗力度和抽驗范圍，完善和優化抽樣模式，使抽驗結果可以反映該類產品的真實質量情況。建議將試劑盒的抽驗結果作為有效的參考數據，將監督抽驗作為一項延續性的工作，在不同年度通過連續跟蹤的方式動態評價試劑盒的質量變化，督促企業不斷改進產品質量。