2種國產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測結(jié)果的比較與分析

丁曉燕 柯志意 朱秀云 鄭海霞 袁靜 潘延超 張明霞

2019年12月，在中國武漢市爆發(fā)了由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2，此前稱2019-nCoV）引起的肺炎疫情，隨后在全中國乃至全世界引起流行。2019-nCoV 傳染性強(qiáng)，主要經(jīng)過呼吸道飛沫傳播或者接觸傳播[1]，短期內(nèi)造成了大量人群的感染，嚴(yán)重危害了人類健康。

當(dāng)前新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的確診一般需要結(jié)合流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和病原學(xué)證據(jù)，并且目前病毒病原學(xué)檢測對新型冠狀病毒肺炎的診斷起決定性作用。病毒病原學(xué)檢測主要針對病毒的核酸進(jìn)行檢測分析，現(xiàn)2019-nCoV 的核酸檢測主要有兩種方法[2]，一種是對患者呼吸道、血液或糞便等標(biāo)本中病毒顆粒的核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time PCR，qPCR）分析；另一種是進(jìn)行基因測序，由于基因測序耗時(shí)長，成本較高，所以對病毒核酸進(jìn)行qPCR 是當(dāng)前階段的主要檢測方法。核酸檢測具有早期、敏感、特異性高、易操作等優(yōu)勢[3]，但是對于核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性還需要考慮樣本類型、樣本質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)因素、試劑盒性能和患者病程等方面，所以在以病毒核酸檢測陽性是新型冠狀病毒肺炎診斷金標(biāo)準(zhǔn)的情況下，試劑盒的準(zhǔn)確性和靈敏性凸顯其重要性。

本研究對深圳市定點(diǎn)收治醫(yī)院（深圳市第三人民醫(yī)院）2020年2月9日到2月11日期間用兩種國產(chǎn)核酸檢測試劑盒檢測的101 份樣本結(jié)果進(jìn)行了對比，評價(jià)不同試劑盒檢測性能有無差異，從而發(fā)現(xiàn)和提出目前2019-nCoV 核酸檢測試劑盒需要改進(jìn)之處，提高臨床檢測的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料與試劑

1.1.1 臨床資料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意（批件號[2020-061]號），采集2020年2月9日和2月11日期間深圳市第三人民醫(yī)院疑似和確診的新型冠狀病毒肺炎患者的鼻咽拭子和痰液，共101例，其中男性48例，女性53例，平均年齡（42.02±19.25）歲，提取核酸進(jìn)行檢測。

1.1.2 主要試劑與儀器

本研究中所有樣本核酸提取采用磁珠法RNA提取試劑盒及其配套的核酸純化儀（杭州博日科技有限公司），q-PCR 系統(tǒng)均為ABI 7500（美國Thermo Fisher）；選取2個(gè)不同企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒，分為A、B 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中A組試劑[A 試劑購自達(dá)安基因，新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），批號：2020007為本院在用的臨床診斷COVID-19 的實(shí)驗(yàn)室參考試劑，即本院判斷臨床樣本結(jié)果以A 試劑結(jié)果為參考]。B組試劑[B 試劑購自泰樂德，新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針），批號：20200102]。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

實(shí)驗(yàn)及相關(guān)醫(yī)護(hù)人員均嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194 號）[4]、《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）的通知》（國衛(wèi)辦科教函[2020]70 號）[5]及《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南（第二版）》[6]等相關(guān)文件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和生物安全防護(hù)。

每份樣本同時(shí)使用A組和B組試劑進(jìn)行平行檢測，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。核酸擴(kuò)增：使用ABI 7500 PCR 儀根據(jù)不同廠家試劑說明書設(shè)置反應(yīng)程序、擴(kuò)增檢測并對結(jié)果進(jìn)行陰性、陽性判定。質(zhì)量控制：每批實(shí)驗(yàn)均帶陰性和陽性對照，陰性和陽性對照檢測結(jié)果在控，則該批次實(shí)驗(yàn)有效，反之無效。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 7.00 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種試劑的基本情況的比較

兩種核酸檢測試劑盒均使用PCR-熒光探針法，且均為雙靶標(biāo)檢測，檢測基因類型均為ORF1a/b和N 基因。其中試劑A 包含內(nèi)源性檢測系統(tǒng)（內(nèi)標(biāo)基因探針采用Cy5 標(biāo)記），其檢測靈敏度為500 copies/mL；而試劑B 檢測靈敏度為3 000 copies/mL。兩種試劑盒體系配制、RNA 上樣量、熒光檢測和擴(kuò)增程序及結(jié)果判讀方面稍有差異。本研究采用的標(biāo)本類型包括鼻拭子、咽拭子和痰液，均包含在這兩種試劑盒用途范圍內(nèi)。見表1。

2.2 兩種試劑檢測結(jié)果比較

根據(jù)試劑盒說明書，將本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法判斷陰陽性記為可疑，即A組中僅有單一通道≤40的樣本記為可疑；B組中單一通道＜38 或者兩個(gè)通道Ct 值均在38 到45 之間的記為可疑。試劑A 陽性率為31.68%，陰性率為55.45%；B 試劑陽性率為34.65%，陰性率為52.48%。差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2 及圖1。

表1 兩種試劑基本情況比較Table1 Compare the basic case of the two reagents

表2 兩種試劑檢測結(jié)果比較Table2 The result of the 2 reagents

圖1 兩種試劑檢測結(jié)果圖Figure1 The test results of the two reagents

2.3 兩種試劑盒對兩個(gè)基因的檢測效果比較

為分析試劑盒對檢測位點(diǎn)ORF1a/b基因和N 基因的檢測效果，分別對檢測的101例樣本進(jìn)行了單個(gè)基因的檢出結(jié)果統(tǒng)計(jì)，根據(jù)各試劑盒說明書，將無法判斷陰陽的記為無效，即將A組中檢測出Ct 值但是Ct 值大于或等于40 記為無效；將B組中Ct 值范圍在38～45（包括端點(diǎn)值）之間的記為無效。分析發(fā)現(xiàn)，A、B 兩種試劑盒對N 片段檢出率均大于對ORF1a/b的檢出率見表3。

表3 兩種試劑單通道檢測率分析[n（%）]Table3 Single-channel detection rate analysis of 2 reage[n（%）]

2.4 兩種試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

為比較兩種試劑盒檢出Ct 值的相關(guān)性，本研究在101例樣本選取其中符合《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）的通知》（國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕145 號）[7]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的14例臨床確診為COVID-19 患者樣本，比較其qPCR Ct 值，隨后進(jìn)行相關(guān)性分析?？芍诖_診患者的檢測結(jié)果中A 試劑盒的Ct 值在ORF1a/b位點(diǎn)的數(shù)值較B 試劑盒偏高，而在N位點(diǎn)兩種試劑盒檢測結(jié)果非常相近。見表4和圖2。

3 討論

新型冠狀病毒是屬于網(wǎng)巢病毒目（Nidovirales）下的冠狀病毒科（Coronaviridae），病毒顆粒由基因組和結(jié)構(gòu)蛋白組成，其基因組是線性單股正鏈RNA[8]，包含7～14個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORFs），從5'端開始，基因1 包含基因組的三分之二，長度為20～22 kb，由兩個(gè)重疊的開放閱讀框1a和1b組成，共同起著病毒RNA 聚合酶（Pol）的作用。而結(jié)構(gòu)蛋白一般有3種：核衣殼（Nucleocapsid，N）蛋白、突刺（Spike，S）蛋白、跨膜（Membrane，M）蛋白[9]。

表4 兩種試劑盒對14例陽性樣本檢測Ct 值Table4 Ct values of 14 positive samples

圖2 兩種試劑檢測14例陽性樣本檢測結(jié)果圖Figure2 The results of 14 positive samples tested by 2 reagents

qPCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性是新冠肺炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法是將2019-nCoV 的全基因組RNA 序列上高度保守的序列片段作為目標(biāo)序列，現(xiàn)行的2019-nCoV 核酸檢測基本都是采用該病毒的開放閱讀框1a/b和核衣殼蛋白基因區(qū)域?yàn)闄z測位點(diǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)中使用的兩種試劑盒的靶點(diǎn)也是2019-nCoV 的ORF1a/b位點(diǎn)和N位點(diǎn)，同時(shí)檢測兩種靶標(biāo)，可以提高臨床診斷效率。

本研究用兩種國產(chǎn)試劑對101例樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示本研究現(xiàn)使用的試劑盒性能相近，但是其具體效果如何仍需要繼續(xù)分析，并且兩個(gè)試劑盒的可疑率均為12.87%，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室檢查中對可疑的樣本需要進(jìn)行復(fù)測，在面對大量樣本時(shí)這無疑會加大檢驗(yàn)人員的工作量，所以如何降低可疑率也是值得探討的問題。

統(tǒng)計(jì)101例樣本中，試劑A和試劑B 各自的單通道檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種試劑對N 片段的檢出率均大于ORF1a/b片段的檢出率，推測兩種試劑盒中N 片段的敏感性較ORF1a/b片段靈敏，一般而言，敏感性與特異性呈負(fù)相關(guān)，所以本實(shí)驗(yàn)中兩種試劑盒的N 片段特異性較ORF1a/b片段低，但是是否當(dāng)前2019 nCoV 檢測試劑盒中N 片段特異性都較ORF1a/b片段低，還需要進(jìn)行深入分析。

本研究在101例樣本中選出14例確診病人的結(jié)果進(jìn)行兩種試劑盒檢出的Ct 值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩種試劑盒對于兩個(gè)通道的結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)，對于ORF1a/b位點(diǎn)試劑A 檢出的Ct 值較試劑B高，而對于N位點(diǎn)的檢出結(jié)果非常相近，推測兩種試劑盒N 片段的檢測性能較ORF1a/b更接近。