枯草芽孢桿菌的篩選及其與光合細菌復配對養殖水體的凈化

劉珍珠 樊振 劉歡歡

摘要：以光合細菌和枯草芽孢桿菌為試驗菌種，研究二者最優濃度配比，應用在實際生產中提高降解水體氨氮、NO-2和化學需氧量（COD）濃度的能力。測定7種枯草芽孢桿菌的生長曲線，選取生長性能較好的菌株K1、K2、K3進行產酶活性檢測，篩選出菌株K3進行復配試驗，試驗設置1個對照組（CK）和7個復合菌組（P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7），7個復合菌組（光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）的濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3），分析各試驗組的氨氮、NO-2和化學需氧量等水質指標，選取處理結果最優的復合菌組。結果表明，復合菌能夠明顯降低水體氨氮，其中P6降解能力最強，降解效果高于對照組4.9倍;能去除亞硝酸根濃度和水體中的化學需氧量。復合菌組的最佳濃度配比為1 ∶ 2，該濃度配比組較對照組和其他試驗組能夠明顯凈化養殖水質，有效提高凈化水質能力。

關鍵詞：光合細菌（Photosynthetic bacteria）;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;復合菌;養殖水體;凈化水質

中圖分類號： S182;X52? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0164-04

近年來隨著我國水產養殖業的迅速發展，工業化的高密度養殖不斷擴大，與此同時，未處理養殖廢水和工業、生活污水的排放不僅使環境受到嚴重的污染，還影響人們的生活用水衛生問題。養殖生態環境遭到破壞，致使養殖業病害頻繁發生[1]。池塘自凈與調節能力并不能滿足清除殘餌、魚蝦排泄物等富營養因子的需要，養殖水體中氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫化物等嚴重超標，池塘水質惡化，魚蝦病害頻頻發生[2]。為了解決上述問題，抗生素和各類化學藥劑在養殖池塘中大量而頻繁的施用，嚴重破壞了養殖環境的生物體系，不僅使養殖池塘的微生態失調，而且使農藥殘留超標，污染養殖水環境[3]。微生態制劑凈水以其高效率、低成本、見效快成為最有前景的凈水方法。目前應用的凈水微生態制劑主要種類有光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌和酵母菌等。光合細菌能夠改善水質，增加溶氧，降低氨氮，增加生產力[4]。枯草芽孢桿菌可以減少病害，降低氮磷，增加溶氧，增產增效[5-6]。兩者結合起來使用會產生不一樣的效果。有關光合細菌和芽孢桿菌協同凈化水質的研究已有報道，羅勇勝等研究認為，光合細菌與枯草芽孢桿菌二者協同凈化作用效果較好[7];李君華等研究認為，二者協同作用能凈化水質，提高刺參免疫能力[8];姜海明等研究發現，光合細菌和芽孢桿菌使用濃度比例為3 ∶ 1時，對烏鱧養殖水的氨氮和化學需氧量（COD）去除率最高[9]。因此，本研究擬通過對光合細菌和枯草芽孢桿菌2種菌設置不同濃度配比進行水質指標檢測，來確定養殖水質凈化作用的最優配比，以期得到養殖生產中復合菌的最佳濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與水體來源 試驗所用光合細菌為新疆農業科學院微生物應用研究所生態實驗室保藏，枯草芽孢桿菌菌粉、養殖廢水由新疆昌吉天康畜牧科技有限公司提供。

1.1.2 培養基 本試驗所使用的光合細菌培養基為RCVBN培養基。RCVBN培養基配方：乙酸鈉 3.00 g，丙酸鈉1.00 g，硫酸銨1.00 g，硫酸鎂 0.20 g，氯化鈉1.00 g，磷酸二氫鉀0.30 g，磷酸氫二鉀0.50 g，氯化鈣0.05 g，酵母膏0.10 g，微量元素1.00 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值調至7.0。

枯草芽孢桿菌活化、生長培養基為LB培養基。LB培養基配方：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。

枯草芽孢桿菌活性檢測培養基。淀粉酶培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉 2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。蛋白酶培養基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，酪素 5 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。纖維素酶培養基：羧甲基纖維素鈉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調至 7.2～7.4，瓊脂粉20 g。

1.1.3 試驗儀器 單人雙面凈化工作臺（SW-CJ-1F），購自蘇州凈化設備有限公司;恒溫培養振蕩器（ZWY-2102C），購自上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫培養箱（SPX-250BF2），購自上海福瑪實驗設備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070），購自上海鴻都電子科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75 SII），購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠;電子天平（JW-B5003，0.001 g），購自諸暨市超澤衡器設備有限公司;調速型迷你離心機（Super Mini Dancer），購自生工生物工程（上海）股份有限公司;pH計（MT-5000），購自上海精密科學儀器有限公司;紫外分光光度計（UV-2550），購自日本島津自動化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長性能良好的枯草芽孢桿菌篩選

1.2.1.1 生長曲線的測定 將筆者所在實驗室選購的7種菌粉標記為K1、K2、K3、K4、K5、K6、K8，稱取0.1 g用無菌梯度稀釋法，稀釋涂布于LB培養基，置于37 ℃培養箱中培養，直至長出明顯的單菌落，挑取單菌落于LB培養液中分別在20、25 ℃ 2種溫度的培養箱里培養，每2 h取樣測量1次菌液濃度，并觀察這7種枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.2.1.2 產酶活性的檢測 選取其中生長活性最好的枯草芽孢桿菌，用打孔法檢測其產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等3種酶的活性，分別在淀粉酶培養基、蛋白酶培養基和纖維素酶培養基上用打孔法將培養24 h后的枯草芽孢桿菌菌液用移液槍吸入孔中，置于37 ℃培養箱中培養24 h后觀察產酶圈。

1.2.2 枯草芽孢桿菌和光合細菌的復配試驗

1.2.2.1 復配菌的制備 將純化培養的2種菌按照比例配制，試驗設置1個對照組（不添加菌）和7個復配菌組，7個復配菌組（光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3）。光合細菌活菌數為1.3×109 CFU/mL，枯草芽孢桿菌活菌數為5.17×1011 CFU/g。枯草芽孢桿菌每份加菌量為0.002 5 g，光合細菌添加量每份為13 mL。

1.2.2.2 實驗室模擬生物降解試驗設計 取塑料箱（0.5 m×0.4 m×0.5 m），每個加入養殖池塘水（稀釋豬糞水）13 L，復合菌劑投放量為50 mL（濃度3.85 mL/L），試驗組除對照外共有7組，每組2個平行。在室內光照，溫度控制在30 ℃條件下培養并觀察。分析各試驗組的化學需氧量濃度（高錳酸鉀法）、氨氮含量（納氏試劑）、亞硝酸根含量等水質指標。每隔1 d測定1次，連續測定8 d。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

如圖1所示，在培養時間為26 h內，當培養溫度為20 ℃時，菌種K1的生長速率最快，在培養26 h時，菌液濃度最高;菌種K2的生長速率次之，其次是菌種K3。當培養溫度為25 ℃時，菌種K1、K2和K3的生長速率較快，菌液濃度較高。因此，選擇K1、K2和K3這3株菌進行產酶活性檢測。

2.2 產酶活性能力檢測結果

對K1、K2和K3這3株枯草芽孢桿菌進行產蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性能力檢測，結果如表1所示，菌種K1產蛋白酶圈直徑為1.680 cm，產淀粉酶圈直徑為0.832 cm，產纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K2產蛋白酶圈直徑為1.836 cm，產淀粉酶圈直徑為0.828 cm，產纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K3產蛋白酶圈直徑為2.160 cm，產淀粉酶圈直徑為 1.236 cm，產纖維素酶圈直徑為 0.000 cm。菌株K3的產蛋白酶和產淀粉酶活性能力比菌種K1和K2強， 菌種K1和K2產蛋白酶與產淀粉酶的活性能力相當，3株菌的產纖維素酶活性能力都很弱，產纖維素酶圈直徑都為0.000 cm。因此選擇K3菌株與光合細菌進行復配。

2.3 不同處理對NH+4降解效果的影響

如圖2所示，CK（對照組）對NH+4濃度的降解趨勢最緩，最終結果與原始相差不大。而其他復合菌組對NH+4濃度的降解速率在前8 d均快于CK，其中P6組的降解速率比其他組快，P3和P7組降解速率為7組復合菌組中最慢。

2.4 不同處理對NO-2降解效果的影響

如圖3所示，CK的降解速率比復合菌組的慢，但是總體差異不明顯，各組對NO-2的降解速率差異不明顯。

2.5 不同處理對COD降解效果的影響

如圖4所示，CK的COD隨培養時間的延長呈上升趨勢，與復合菌組呈現差異明顯，P1與P7組對COD的降解能力較強。

3 討論與結論

本研究結果表明，光合細菌、枯草芽孢桿菌以及

復合菌都能有效降低水體氨氮、化學需氧量和NO-2濃度的能力。光合細 菌 ∶ 芽 孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時，對水中氨氮的降解效果最好，比對照組高出4.9倍，比單一光合細菌（P1）與單一枯草芽孢桿菌（P2）分別高出1.9、1.5倍，復合菌效果明顯優于單一菌。因為養殖池塘水體中飼養魚類喂食的餌料較多，所以水體中的氨氮含量增加，氨氮容易引起水中藻類及其他微生物大量繁殖，形成富營養化污染，使水中溶解氧含量下降，魚類大量死亡，甚至會導致湖泊干涸。由于氨氮對養殖水體的危害較大，就不得不尋找其他方法來解決現存的高密度養殖后果。

光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時，對水體中亞硝酸鹽降解效果最好，其降解率是CK組的1倍，但與其他復合菌組處理效果差異不明顯。養殖池塘由于大規模高密度的養殖，很容易造成水體缺氧，在厭氧狀態下，水體中的硝酸根離子還原成亞硝酸根離子，亞硝酸根離子大量積累，對養殖水體的環境與養殖動物造成嚴重危害。而光合細菌與芽孢桿菌對于水體中氨氮的去除能力較強，因此，在養殖池塘中添加微生態制劑是一種較好的解決方案。

光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 3（P7）時，對水體中化學需氧量降解效果最好，在培養時間內，對照組的COD呈現上升趨勢，P7組對COD的降解明顯，降解效率高于單一組1.9倍。COD是評價水體質量的重要指標，COD的高低在很大程度上反映水環境的有機污染或水體的清潔度[10]。光合細菌在厭氧條件下可以固定CO2，也可以利用低級脂肪酸、氨基酸等作為碳源進而降低COD[10]。芽孢桿菌是具有高活性消化酶系的異養菌，能迅速將養殖水體中的有機物分解為小分子有機酸、氨基酸及氨，從而降低COD。2種細菌都具有降解有機物的能力，二者存在共生關系[11-12]。P7組中復合菌濃度比例取得最好的COD降解效果，說明兩者共生達到平衡，都能夠發揮各自的有機物降解能力，達到最佳降低COD的效果。

微生態制劑的使用不但提高了水產養殖業中降解有機污染的能力，還大大節省了養殖成本，其中光合細菌既能發揮高效的降解作用，利用水體中有毒的胺、H2S等，還能分泌一些對養殖動物有益的活性物質[13]。枯草芽孢桿菌除了可以限制養殖水體中有害菌的生存和繁殖，養殖動物食用后可改善體內生態環境，并對動物某些疾病有防治作用。復合菌的使用既可以使各類微生物都各自發揮優勢，又能相互利用、取長補短，使利益最大化。

參考文獻：

[1]孫德文，詹 勇，許梓榮. 微生態制劑在水產養殖中的應用[J]. 淡水漁業，2002，32（3）：54-57.

[2]王興禮，葉志慧. 魚類健康養殖的技術措施[J]. 內陸水產，2008，33（6）：8-9.

[3]李南充. 微生態制劑在池塘養殖中的應用研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2013.

[4]謝德兵，朱思華，谷 融，等. 光合細菌在鱖魚養殖中應用效果[J]. 科技創業月刊，2017，30（5）：117-119.

[5]Wang Y B，Xu Z R，Xia M S. The effectiveness of commercial probiotics in northern white shrimp Penaeus vannamei ponds[J]. Fisheries Science，2005，71（5）：1036-1041.

[6]張克強，李 野，李軍幸. 芽孢桿菌菌劑在水產養殖中的應用初探[J]. 海洋科學，2006，30（9）：88-91.

[7]羅勇勝，李卓佳，楊鶯鶯，等. 光合細菌與芽孢桿菌協同凈化養殖水體的研究[J]. 農業環境科學學報，2006，25（增刊1）：206-210.

[8]李君華，劉佳亮，曹學彬，等. 芽孢桿菌與光合細菌協同作用對養殖刺參的影響[J]. 漁業現代化，2013，40（1）：7-12.

[9]姜海明，楊騰騰，馮 磊，等. 芽孢桿菌與光合細菌對烏鱧養殖水的凈化作用研究[J]. 湖北農業科學，2010，49（6）：1428-1430.

[10]柯細勇，康 旭，趙志偉，等. 水質指標COD的優缺點及其測量方法發展[J]. 環境科學與技術，2011，34（6）：255-258.

[11]杭小英，葉雪平，施偉達，等. 枯草芽孢桿菌制劑對羅氏沼蝦養殖池塘水質的影響[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），2008，27（2）：197-200.

[12]湯保貴，徐中文，張金燕，等. 枯草芽孢桿菌的培養條件及對水質的凈化作用[J]. 淡水漁業，2007，37（3）：45-48.

[13]何若天，何勇強，農友業. 農用益生菌生產與應用手冊[M]. 北京：金盾出版社，2015：35-124.姚晶晶，陳麗君，王明銳，等. 西瓜中殺線蟲劑農藥殘留及風險評估[J]. 江蘇農業科學，2020，48（6）：168-172.