城市園林廢棄物中纖維素高效降解微生物菌系的構建

路強強 趙葉子 陳智坤

摘要：采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈法、濾紙條崩解法、酶活力比較法、枯莖降解失重法，研究13種常用的纖維素降解菌菌株和5個組合菌系對纖維素的降解效率，結果表明，模式菌種白腐菌（F-6）對CMC-Na具有非常好的降解作用，且產酶活性顯著高于其他12種單一菌株（P<0.05）;與未接種菌系（株）相比，組合菌系的濾紙條崩解速率有明顯提高;由“鏈霉菌屬A-1+潮濕纖維單胞菌B-3+熱帶假絲酵母F-5+白腐菌F-6”構建的菌系JX-1產葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶活性分別為25.12、14.41、18.54 U/mL，顯著高于其他4個菌系，恒溫培養5、10、15 d時的枯莖降解失重率分別較白腐菌顯著提高151.94%、73.21%、67.49%，菌系JX-1為園林廢棄物堆腐發酵實現纖維素高效降解的最佳微生物組合。

關鍵詞：園林廢棄物;纖維素;降解;酶活;白腐菌;微生物菌系

中圖分類號：S182?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0272-06

近年來，隨著美麗中國理念的深化和生態城市建設規模的擴張，我國城市綠化水平、整體綠量均得到不斷提高，同時也產生了大量園林綠化廢棄物。城市園林廢棄物主要是指在城市綠地、行道樹及城郊林地中綠化植物自然或養護過程中產生的草坪、枯枝落葉及林木修剪物等，含有大量的淀粉、纖維素、木質素和營養元素，是一種可再利用的有機資源，也是生態系統物質循環的重要組成部分[1-2]。然而，作為城市固體垃圾的主要來源，每年有近 5 000 萬t的園林廢棄物進入環衛填埋系統，這不僅造成園林生物質資源浪費和垃圾填埋場收納能力的下降，也易導致周圍水體、大氣和土壤環境的二次污染。

目前，關于城市園林廢棄物的資源化利用主要是就地粉碎作為綠化土壤覆蓋物或簡易堆肥作為植物生長基質，但存在粉碎時易產生揚塵、堆腐不透徹時易孳生病菌和臭氣等問題[3-4]。經過一定預處理，在適宜條件下利用好氧微生物進行堆肥發酵，以促進大分子有機物降解和腐殖質類物質形成，這是實現園林綠化廢棄物資源化、高效化利用的主要途徑[5-7]，而構建快速降解、徹底腐熟的微生物菌系是促進大分子物質分解、轉化及合成土壤有機質、植物生長營養物質的關鍵[8-10]。有研究表明，纖維素酶主要包括葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶，是催化纖維素快速水解、誘導木質素降解酶（胞外過氧化酶、胞外酚氧化酶）產生的核心酶系，它們協同作用可將纖維素水解、降解為纖維低聚糖及葡萄糖[11-17];而產纖維素酶的微生物菌系組合與劑量差異在很大程度上影響堆肥過程中堆體的升溫速率和腐熟徹底性[18-19]。

本研究結合菌間拮抗關系，采用羧甲基纖維素鈉水解透明圈法、濾紙條崩解法、酶活力比較法及枯莖降解失重法，對微生物肥料中常用的13種纖維素降解菌進行單一菌株篩選和組合菌系復配，以期獲得高效降解園林廢棄物中纖維素的復合微生物菌系，為城市園林綠化廢棄物的資源化處置與高效化利用提供參考依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 降解纖維素常用的13種功能菌株（表1）由中國工業微生物菌種保藏管理中心、中國普通微生物菌種保藏管理中心、陜西省科學院土壤資源與生物技術應用重點實驗室、陜西省微生物研究所提供，經陜西省微生物研究所孫曉宇副研究員菌間拮抗關系鑒定，表明菌株相互間無拮抗關系、無抑制孢子產生作用。

1.1.2 菌株培養及發酵 細菌采用營養肉湯培養基（NA）發酵培養，培養基組分為：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為 7.0～7.2;發酵條件為：裝液量50 mL/250 mL三角瓶，培養溫度32 ℃，搖床轉速160 r/min，培養時間24 h。

真菌采用馬鈴薯培養基（PDA）發酵培養，培養基組分為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;發酵條件為：裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養溫度為28 ℃，搖床轉速為160 r/min，培養時間為72 h。

放線菌采用馬鈴薯改良培養基（PDA+）發酵培養，培養基組分為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂2 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;發酵條件為：裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養溫度為28 ℃，搖床轉速為160 r/min，培養時間為48 h。

1.1.3 菌系組合與發酵 在單株初篩的基礎上，選擇降解纖維素效率較高的菌株組合成5個菌系，每組菌系至少包含細菌、真菌、放線菌各1株（表2），由于白腐菌為降解纖維素的模式菌，設計每組菌系時均含有該菌株[20-22]。根據各菌種差異進行單獨培養，再等體積比例混合。發酵條件為：液體裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養溫度為30 ℃，搖床轉速為160 r/min，培養時間為36～48 h。

1.1.4 菌種斜面和平板的制備 制備不同菌種斜面和平板時，在每1 000 mL相應液體培養基中添加瓊脂15～20 g，經高溫高壓濕熱滅菌，自然冷卻即可，滅菌溫度為121 ℃，滅菌時間為20 min。

1.2 微生物對纖維素降解效率的測定

1.2.1 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈法測定 將各菌株直徑為1 cm的菌餅分別接種至CMC-Na平板培養基上培養24～72 h，以不添加任何菌株作為空白對照（CK）;0.1%剛果紅水溶液浸染30 min，棄染液，用1 mol/L NaCl水溶液脫色1 h;分別測定菌落直徑（d）、水解透明圈直徑（D），單位為cm;計算CMC-Na水解透明圈的Dp值表示菌株降解纖維素的能力[23]，公式為：

Dp = （D/d）2。

1.2.2 濾紙條崩解法測定 各菌株采用相對應的液體培養基和發酵條件進行三角瓶培養，以不添加任何菌株作為空白對照（CK）;每瓶中放置1 cm×6 cm 濾紙條3片，重復3次;每隔3 h觀察并記錄濾紙條崩解情況和時間[24]。

1.2.3 酶活力法測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[25-26]測定葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶活力，用1 mL酶底物反應液1 min催化纖維素水解產生還原糖（葡萄糖）的量（μmol）反映微生物對纖維素的降解效率。測定內切酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數的粗酶液0.5 mL，加入pH值為5.0的1% CMC-Na檸檬酸緩沖液1.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。測定外切酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數的粗酶液0.5 mL，加入pH值為5.0的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液1.5 mL、脫脂棉50 mg，50 ℃恒溫水浴60 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。測定苷酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數的粗酶液0.5 mL，加入檸檬酸緩沖液1.5 mL、脫脂濾紙條50 mg，50 ℃恒溫水浴60 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。處理液均采用TECAN Infinite 200 PRO酶標儀測定波長為540 nm處的吸光度值，以不添加任何菌株處理的作為空白對照（CK），并根據葡萄糖標準曲線折算酶活。酶活計算公式為：

X=（A×N）/（V×T×M）。

式中：X表示纖維素酶活力，U/mL;A表示根據吸光度值在葡萄糖標準曲線獲得的還原糖生成量，μg/mL;N表示粗酶液的稀釋倍數;V表示加入酶液的體積，即為0.5 mL;T表示酶促反應時間，內切酶為30 min，外切酶和苷酶為60 min;M表示葡萄糖的分子質量，為180。

1.2.4 枯莖降解失重率法測定 2017年11月，采集西安植物園水景區自然枯萎蘆葦[Phragmites australis （Cav.） Trin. ex Steu]的莖稈、枯葉、花穗，其基本物料有機質、全碳、全氮含量分別為830.06、481.47、4.15 g/kg，碳氮比為116.02，pH值為7.8;風干，并剪碎至1～2 cm細條，經濕熱滅菌法滅殺雜菌及蟲卵;無菌水浸泡過夜，并沖洗可溶性有機物;105 ℃烘干，待用;稱取已處理的枯莖10 g、硫酸銨0.4 g、硫酸鎂0.1 g裝入250 mL三角瓶，每瓶加入pH值為7.0的5 mmol/L磷酸緩沖液30 mL、混合菌懸液6 mL，以加入6 mL蒸餾水為空白對照（CK）;混勻，50 ℃恒溫培養15 d;每菌系處理9組，并分別在恒溫培養5、10、15 d時觀察枯莖的降解情況，每次取3組，蒸餾水洗滌、過濾其降解物，剩余物105 ℃烘干至恒質量，稱量未降解枯莖質量，計算其降解失重率[27]。降解失重率計算公式為：

D=（Mp-Ms）/Mp×100%。

式中：D表示降解失重率，%;Mp表示降解前枯莖質量，即為10 g;Ms表示未降解物質量，g。

1.3 數據統計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行整理與制圖，采用DPS 9.50軟件進行差異性顯著分析，顯著性檢驗采用最小顯著性差異檢驗法（LSD法）（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 單一菌株對纖維素的降解效率

2.1.1 CMC-Na水解透明圈法測定 葡聚糖內切酶對CMC-Na具有很強的水解能力，測定計算CMC-Na水解透明圈的Dp值，可反映不同菌株產內切酶的活力水平，進而可有效反映降解纖維素分子內多聚糖的能力[28]。由表3可見，模式菌種白腐菌（F-6）對CMC-Na具有非常好的降解作用，其水解透明圈Dp值相對最高，達7.23;按照菌種的種屬類型，Dp值大小由高到低大致呈：真菌>放線菌>細菌;真菌F-3、F-2、F-5的Dp值相對偏高，分別為6.95、6.41、5.54，放線菌中菌株A-1的Dp值相對較高，為6.22，細菌中菌株B-3、B-4、B-2的Dp值相對較高，依次為5.37、4.43、3.49。

2.1.2 濾紙條崩解法測定 纖維素酶是具有纖維素降解能力酶的總稱，在相同培養條件下，不同微生物菌株對濾紙條的崩解速率差異可反映其產纖維素酶的生物代謝活力大小，從而進一步可反映降解纖維素的能力。由表3可見，放線菌、細菌類菌株對濾紙條崩解所需時間相當，為30 h左右，而真菌類所需時間相對長，約為36 h;放線菌中，菌種A-1的崩解時間相對最短，為29 h;細菌中，菌株B-3、B-2、B-4導致濾紙條崩解時間相對較短，分別為25、29、29 h;真菌中，菌株F-3、F-1、F-4、F-6崩解濾紙條的時間相對較短，分別為34、35、36、36 h。

2.1.3 酶活力法測定 葡聚糖內切酶能在纖維素分子內部任意裂解β-1，4糖苷鍵，而外切酶主要從纖維素分子的非還原端依次裂解β-1，4糖苷鍵，釋放纖維二糖分子。由表3可見，真菌菌株F-6、F-5、F-3的產內切酶活性分別為21.51、19.78、7.35 U/mL，產外切酶活性分別為14.33、12.38、548 U/mL，顯著高于放線菌、細菌和其他真菌（P<0.05），真菌菌株F-6、F-5產苷酶活性分別為16.02、12.60 U/mL，顯著高于放線菌、細菌和其他真菌;放線菌中，菌株A-1產內切酶、外切酶、苷酶活力相對較高，對應各酶活性分別為5.04、4.00、6.03 U/mL;細菌中，各菌株產內切酶活力相對較低，酶活性在1.36～1.73 U/mL之間，其中菌株B-3的產內切酶活力相對最高，菌株B-3、B-2、B-1產外切酶和苷酶活力相對較高，酶活性分別為 2.84、2.72、2.19 U/mL和3.29、3.38、3.15 U/mL。

2.3 組合菌系對纖維素的降解效率

2.3.1 濾紙條崩解法測定 由表4可見，5個組合菌系在25～30 h內可徹底崩解濾紙條，其中，JX-1的濾紙條崩解速率相對最快，崩解時間約為25 h。

2.3.2 酶活力法測定 由表4可見，組合菌系的產纖維素酶活力明顯高于單一菌株，相互間存在顯著性差異（P<0.05）;菌系JX-1、JX-2、JX-3產內切酶活力相對較高，酶活性分別為25.12、22.23、20.52 U/mL，菌系JX-1、JX-2、JX-5產外切酶和苷酶活力相對較高，酶活性分別為14.41、14.07、13.64 U/mL和18.54、17.16、16.17 U/mL。

2.3.3 枯莖降解失重率法測定 測定枯莖降解失重率可真實反映微生物菌系對園林廢棄物的降解效率，體現菌系所產纖維素酶、木質素酶及其他酶的活力水平。本試驗發現，在蘆葦枯莖混合液中接種5個組合菌系和單一菌株白腐菌（F-6）恒溫培養3 d時，蘆葦枯莖表面均不同程度地有白色菌絲散布生長;恒溫培養8 d時，菌落基本鋪滿枯莖表面，并呈棉絮狀。由圖1可知，恒溫培養5 d時，接種菌系 JX-1、JX-2、JX-5、JX-4的枯莖降解較菌系 JX-3、白腐菌顯著（P<0.05），失重率D值分別為16.15%、13.69%、12.98%、11.19%;恒溫培養10 d時，5個組合菌系枯莖降解失重率達20%左右，其中，失重率最高的為菌系JX-1，其失重率D值達21.11%，顯著高于其他處理;與接種F-6（白腐菌）的枯莖降解失重率相比，菌系JX-1恒溫培養5、10、15 d時的枯莖降解失重率分別顯著提高 151.94%、73.21%、67.49%;恒溫培養15 d時，與未接種菌株（CK）相比，接種各菌系的枯莖降解失重率有顯著提高，其中，接種JX-1、JX-5、JX-2的失重率D值相對較高，分別為33.37%、29.21%、28.87%。

3 結論與討論

纖維素是吡喃型D-葡萄糖殘基以β-1，4-糖苷鍵連接而成的復雜結晶分子，在適宜的發酵培養條件下可通過外源微生物代謝產酶作用，快速實現纖維素聚合物的裂解[29]。纖維素酶是一類能夠任意切斷β-1，4-糖苷鍵的酶總稱，是單一微生物自然代謝和復合微生物協同作用的產物，而接種富產纖維素酶的微生物是實現農林廢棄物快速降解的有效手段[30]。然而，由于單一微生物存在產酶條件和酶類型的差異，導致動態復合酶系不完善，從而對纖維素的降解速率產生影響。本研究通過單一微生物菌株的篩選和復合微生物菌系的構建，旨在獲得園林廢棄物堆腐過程中多樣、高產纖維素酶的微生物菌群。

有研究表明，通過羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈的出現時間可推測菌株產酶時間，水解透明圈Dp值大小可直觀反映菌株產酶能力和酶濃度;濾紙條崩解速率可反映菌株產酶的協同作用，而單一菌株的崩解時間與菌液在波長為600 nm生長曲線的吸光度峰值存在一致性[31];單一菌株酶活篩選過程中，透明圈Dp值、濾紙條崩解速率與菌株產酶能力、酶活力及酶間協同作用存在一定的正相關性[32]。本研究發現，鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）A-1菌株的水解透明圈Dp值為6.22，在試驗放線菌中相對最大，濾紙條崩解速率約為29 h，相對最快，其產葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶活性分別為 5.04、4.00、6.03 U/mL，也相對最高;潮濕纖維單胞菌B-3菌株的水解透明圈Dp值為5.73，在試驗細菌中相對最大，濾紙條崩解時間約為25 h，崩解速率相對最快，其產葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶活性分別為1.73、2.84、3.29 U/mL，也相對最高;白腐菌的水解透明圈Dp值為7.23，在試驗真菌中相對最大，其濾紙條崩解速率約為36 h，并非最快，但其產葡聚糖內切酶、外切酶、苷酶活性分別為21.51、14.33、16.02 U/mL，顯著高于其他單一菌株（P<0.05）。

纖維素降解是多種酶協同作用的結果，單一菌株通常無法產生所有的纖維素酶，而組合菌系可實現酶類型的復合和酶活力的提升，同時可提高降解過程中微生物菌群類型與數量、縮短纖維素降解時間，并促進難降解有機物的轉化。本研究結果表明，與單一菌株相比，5種組合菌系的產酶活性有明顯提高，與白腐菌相比，菌系JX-1、JX-2的產內切酶活性分別較之提高16.8%、3.3%，產苷酶活性提高15.7%、7.1%，菌系JX-1、JX-2中均含有產酶活性相對較高的菌株A-1、F-5、F-6;含單一菌株相對最多的組合菌系JX-5，其產酶活性并非最高，甚至低于模式菌株白腐菌，這說明菌系產酶活性作用的發揮是多種酶有機協同的結果，而并非單一菌株酶活力的數量加和，而菌系中各菌株培養條件的差異對菌系酶活的影響、酶間的協同作用機理等有待深入研究;相對單一菌株，組合菌系的崩解速率有明顯提高，菌系JX-1與潮濕纖維單胞菌菌株B-3的崩解速率一致，崩解時間約為25 h，較熱帶假絲酵母菌株F-5崩解速率提高34.2%;各菌系對蘆葦枯莖的降解效率遠高于白腐菌，菌系JX-1的降解效果相對最佳，恒溫培養5、10、15 d的枯莖降解失重率D值分別為16.15%、21.11%、33.37%，菌系JX-1、JX-2、JX-3、JX-4接種培養15 d時的枯莖降解失重率D值比白腐病菌株 F-6分別提高67.5%、44.9%、39.3%、46.7%。因此，由“鏈霉菌屬A-1+潮濕纖維單胞菌B-3+熱帶假絲酵母F-5+白腐菌F-6”構建的菌系JX-1是促降解園林廢棄物中纖維素相對較好的微生物組合，可應用于城市園林廢棄物的資源化處理。

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