兔流行性腹脹病樣品中產氣莢膜梭菌的分離鑒定

胡波 魏后軍 范志宇

摘要：從發生典型病理特征的兔流行性腹脹病死亡兔盲腸內容物中分離到1株產氣莢膜梭菌，命名為SD14-02。經革蘭氏染色、生化鑒定、16S rRNA比對和毒素型特異性PCR等方法對分離細菌進行鑒定和分型，結果顯示，分離株SD14-02為革蘭氏陽性桿菌，生化鑒定顯示其符合產氣莢膜梭菌的生化圖譜。經系統發育分析，SD14-02的16S rRNA基因序列與產氣莢膜梭菌位于同一分支。經毒素型特異性PCR方法鑒定，SD14-02為A型產氣莢膜梭菌，蛋白電泳顯示其與A型產氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A存在一定差異。動物試驗證明SD14-02對小鼠具有致病性。研究結果為兔流行性腹脹病致病原的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞：兔流行性腹脹病;產氣莢膜梭菌;分離;鑒定

中圖分類號： S858.291? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0160-04

收稿日期：2019-02-14

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：胡 波（1982—），男，江蘇南京人，博士，副研究員，主要從事畜禽疫病防控與獸醫生物技術研究。E-mail：hubolshg@163.com。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事畜禽疫病防控及免疫機理研究。E-mail：rwangfang@126.com。? 兔流行性腹脹病是一種由特定病原菌引起的兔腸道綜合征，具有一定的傳染性和流行性，但病原未知[1]。中國于2004年首次發生該病，且近年來在我國江蘇和山東等省份仍有該病的發生與流行。該病主要發生于斷奶仔兔至4月齡兔，表現為腹部臌脹、膠凍樣黏液排泄物，病理剖檢可見盲腸內容物干硬成塊狀，結腸內存在大量膠凍樣黏液，胃及小腸內充滿液體和氣體，發病兔死亡率最高可達90%以上[1-2]。該病的臨床癥狀與病理變化與1996—1997年法國報道的未知病原的兔流行性腸病[3-4]十分相似，很多學者認為兩者為同一種病[4]。

國外研究表明，兔流行性腸病為多病原共同作用的結果，且產氣莢膜梭菌是該腸道綜合征的重要致病原之一[5-6]。腸道菌群分析也表明梭菌屬是病兔盲腸中特異性升高的致病菌群之一[7]。從病兔盲腸樣品中分離的產氣莢膜梭菌具有一定的致病性，通過口服途徑攻擊斷奶兔后，部分兔表現為盲腸阻塞癥狀，但不能復制出該病的其他特征，也不能引起死亡。這與常見的導致家兔腸毒血癥的A型產氣莢膜梭菌在臨床癥狀和病理變化上有明顯差異。本研究采用產氣莢膜梭菌特異性鑒定培養基成功從兔流行性腹脹病盲腸樣品中分離出1株產氣莢膜梭菌，毒素基因分型結果顯示為A型，且具有致病性，為該病致病原的進一步研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養基

卵黃瓊脂培養基、產氣莢膜梭菌鑒定培養基、多價蛋白胨-酵母膏（PY）培養基均購自青島海博生物科技有限公司;細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司;細菌DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;Pfu高保真酶Mix購自北京擎科生物科技有限公司;凝膠回收純化試劑盒購自TaKaRa公司;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗動物

清潔級ICR小鼠，購自揚州大學比較醫學中心。

1.3 引物

參照Corby-Harris 等的方法[5]合成細菌16S rRNA基因通用引物;根據產氣莢膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA序列，參照Yoo等的方法[8]合成產氣莢膜梭菌特異性分型引物。引物均由上海Invitrogen公司合成（表1）。

1.4 細菌分離培養

取含20%甘油凍存的兔流行性腹脹病盲腸內

容物1 mL，加入2 mL無菌水，混勻后500 r/min離心10 min，取200 μL上層液接種于含5%葡萄糖的PY液體培養基，37 ℃厭氧培養過夜后，劃線于卵黃瓊脂平板，37 ℃厭氧培養24～48 h后，選取具有卵磷脂酶活性的疑似菌落，于產氣莢膜梭菌鑒定培養基平板上進一步分離純化。經多次純化培養后，挑取單個菌落，進行革蘭氏染色及鏡檢觀察。

1.5 分離菌株生化試驗

利用細菌微量生化反應管對分離純化的菌株進行生化指標測定。將菌株接種于葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、水楊苷、硫化氫、吲哚、硝酸鹽（還原）、明膠等微量生化反應管，37 ℃厭氧培養24 h，觀察結果。

1.6 分離菌株16s rRNA基因的分析

1.6.1 分離細菌基因組DNA的提取 采用分離菌株培養物，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌的基因組DNA。

1.6.2 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增 以提取的基因組DNA為模板，應用細菌16S rRNA基因的通用引物進行PCR擴增。反應體系如下：2×PCR Mix 12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，加ddH2O至總體積25.0 μL;后執行下列反應條件：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環;72 ℃ 延伸5 min，結束反應。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，以DNA凝膠回收試劑盒對目的片段進行回收純化。

1.6.3 16S rRNA基因的序列分析 將回收純化的PCR擴增產物直接進行序列測定，由上海Invitrogen公司測序。測序結果在NCBI數據庫中以BLAST程序進行同源性比對，并從RDP數據庫中選取相似性較高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 5.2軟件中Kimura-2參數矩陣的鄰接法構建系統發育樹。

1.7 分離菌株PCR分型鑒定

由表1可知，產氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、iA序列特異性引物對分離菌株進行PCR擴增，以產氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A為對照。反應體系和反應條件同“1.5.2”節PCR擴增條件。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，用凝膠成像系統觀察結果并拍照。

1.8 分離菌株的SDS-PAGE分析

取厭氧培養的分離菌株SD14-02和疫苗株蘇84-A，12 000 r/min離心收集菌體，PBS洗滌2次后冰浴超聲破碎，取全菌蛋白進行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.9 小鼠致病性試驗

將分離菌株培養物經過平板計數后，分別以 1×109 CFU/只和2×109 CFU/只的劑量各腹腔注射6只6周齡ICR小鼠，進行ICR小鼠攻毒試驗。攻毒后觀察并記錄死亡情況，并對死亡動物進行剖檢和細菌分離。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

在厭氧條件下，經過卵黃瓊脂培養基和產氣莢膜梭菌鑒定培養基的分離和篩選，從發生典型兔流行性腹脹病特征的盲腸樣品中分離得到1株產氣莢膜梭菌，命名為SD14-02，革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭氏陽性桿菌（圖1）。

2.2 分離菌株的生化反應

對分離純化的菌株進行了11項生化指標的鑒定，結果顯示，分離菌株符合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）關于產氣莢膜梭菌的生化圖譜（表2）。

2.3 分離菌株16S rRNA分析

以SD14-02株提取的細菌基因組DNA為模板，采用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，獲得大小在1.5 kb左右的特異性條帶。將回收純化的PCR產物進行序列測定，所得基因序列提交GenBank數據庫（GenBank NO. KX986316）。16S rRNA序列在RDP數據庫中比對后，構建系統發育樹，結果顯示，SD14-02與產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）位于同一分支（圖2），表明分離菌為產氣莢膜梭菌。

2.4 分離菌株的基因分型

以產氣莢膜梭菌cpa、cpb、etx、iA序列特異性引物對分離菌株進行PCR擴增，以產氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A株為對照，經電泳鑒定，產氣莢膜梭菌SD14-02和蘇84-A均擴增出大小約為400 bp的特異性條帶，與cpa基因片段大小一致，但未擴增出cpb、etx和iA基因的特異性條帶（圖3）。將擴增得到的陽性基因片段測序后進行BLAST比對，結果顯示其為產氣莢膜梭菌cpa基因，表明分離株SD14-02與蘇84-A一致，為A型產氣莢膜梭菌。

2.5 分離菌株全菌蛋白的SDS-PAGE分析

對分離菌株SD14-02進行全菌蛋白SDS-PAGE分析，以產氣莢膜梭菌疫苗株蘇84-A為對照，經電泳鑒定，兩者的全菌蛋白條帶在40～100 ku 之間有明顯差異（圖4）。

2.6 動物致病性試驗

對產氣莢膜梭菌分離株SD14-02培養物進行平板計數，并將分離菌以不同的劑量腹腔注射ICR小鼠，由表3可知，所有ICR小鼠于2 d內死亡，從小鼠肝臟中可分離到純凈的產氣莢膜梭菌。

3 討論

目前，國內外研究仍未明確兔流行性腹脹病的病原，但部分研究發現病兔盲腸內容物經處理后通過口服可以成功復制該病[6]。國外學者等通過蔗糖密度梯度離心法對盲腸內容物中微生物進行了分層，通過口服攻擊斷奶兔，初步證明兔流行性腹脹病是由細菌感染引起而非病毒或寄生蟲感染引起[6，9]。在此基礎上，也排除了一些通過盲腸菌群比對得到的特殊分離菌是該病病原的可能性，如R6B陽性葡萄球菌[10]。另外，國內外學者發現部分抗生素如泰樂菌素、復方新諾明、恩拉霉素等對兔流行性腹脹病的治療有一定效果[1，2，11]，也提示該病為一種細菌性傳染病。之后，有學者在對盲腸內容物的細菌菌群進行分析時發現兔盲腸中梭菌屬所占比例顯著高于正常對照組[7]，且產氣莢膜梭菌與兔流行性腹脹病的病因密切相關[5，6，12]。單獨分離的產氣莢膜梭菌經口服途徑攻擊，部分斷奶兔可出現兔流行性腹脹病特有的盲腸內容物干硬阻塞的病理變化，但未表現出該病的其他特征[13]。這些研究提示產氣莢膜梭菌可能是兔流行性腹脹病的重要致病原之一，但并非是唯一的致病原。

本研究通過產氣莢膜梭菌特異性分離培養基成功從保存的兔流行性腹脹病樣品中分離到1株產氣莢膜梭菌，且分離菌株在小鼠上具有致病性。由于兔流行性腹脹病與常見的導致家兔腸毒血癥的產氣莢膜梭菌病在臨床癥狀和病理變化上有明顯差異，因此本研究對分離菌株和產氣莢膜梭菌病疫苗菌株進行了毒素基因分型，結果顯示所分離的產氣莢膜梭菌與疫苗株均為A型，但兩者的全菌蛋白條帶在40～100 ku之間有明顯差異，暗示從兔流行性腹脹病樣品中分離的產氣莢膜梭菌SD14-02與蘇 84-A疫苗株有一定差異。本研究將為進一步分析新型產氣莢膜梭菌與疫苗株的差異及其與致病性的關系奠定基礎。

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