百日菊白粉菌的分子檢測與鑒定

劉閏 周暄 邢帥

摘要：對百日上的白粉菌進(jìn)行分子生物學(xué)分析，采用試劑盒法提取病原菌總基因組DNA，PCR擴(kuò)增其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，簡稱ITS）的保守序列并測序，并通過Clustal與MEAG軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹推演系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，在分子水平鑒定該菌種并比較與其他白粉菌菌種的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，本研究測序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列與發(fā)生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum（KF453969.1）相似度達(dá)到99%，與其具有比較近的親緣關(guān)系。以百日菊白粉菌為研究對象，在分子水平鑒定該菌種并分析其進(jìn)化親緣關(guān)系為本試驗(yàn)的創(chuàng)新之處。

關(guān)鍵詞：百日菊;白粉菌;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū);序列分析

中圖分類號：S435.672? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0098-06

百日菊（Zinnia elegans Jacq.）別稱百日草，為中藥材，以全草入藥。百日菊也是一年生草花主栽品種之一，其色彩豐富，花大、艷麗，花期長達(dá)百日，故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常見的最重要病害之一，在生長區(qū)幾乎每年都普遍發(fā)生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后，最初葉片出現(xiàn)白色粉狀斑點(diǎn)，后病斑擴(kuò)大或相連成片，發(fā)病后期葉面布滿白色粉層，葉片變褐，嚴(yán)重影響觀賞價值，甚至導(dǎo)致植株成片死亡。發(fā)病后期在發(fā)病部位形成的小黑點(diǎn)即為病菌的閉囊殼。據(jù)以前的研究報道有2個屬的白粉菌引起百日菊的白粉病，分別是白粉菌屬（Erysiphe）和單絲殼屬（Sphaerotheca），屬于子囊菌門（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae）[4-7]。

白粉菌傳統(tǒng)的鑒定以其形態(tài)學(xué)為主要特征，如有性世代閉囊殼內(nèi)子囊的個數(shù)及子囊孢子的數(shù)目，閉囊殼外附屬絲的特征等，但傳統(tǒng)的分類特征有諸多不足之處[8-11]。近年來，分子生物學(xué)在植物病害鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛，特別是植物病原菌在rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，簡稱ITS）既具有保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特點(diǎn)，通過特異性引物對ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于快速鑒定、檢測植物病原菌以及病害的診斷等[12-13]。目前國內(nèi)關(guān)于百日菊白粉病病原菌分子分類系統(tǒng)的研究未見報道，通過提取百日菊白粉菌總基因組DNA，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其分類特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，可為該花卉白粉病的準(zhǔn)確調(diào)查提供有效和實(shí)用的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白粉菌樣本于2017年8月12日采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市實(shí)驗(yàn)林場，樣品編號為BC180623，寄主植物為百日菊。提取白粉菌基因組DNA的試劑盒購自盛澤生物試劑有限公司（目錄號：DP321）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品白粉菌的收集 刀片輕輕刮下葉片表面的菌絲與閉囊殼混合物，放入2 mL離心管中，置于-4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用試劑盒法提取百日菊白粉菌基因組DNA：（1）取適量白粉菌菌絲放入研缽中，加入液氮充分研磨;（2）加入400 μL緩沖液FP1和6 μLRNaseA（10 mg/mL），渦旋振蕩 1 min，室溫放置10 min;（3）加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻，渦旋振蕩1 min，12 000 r/min離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，重復(fù)這一步驟;（4）向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，此時出現(xiàn)絮狀基因組DNA，離心2 min，棄上清，保留沉淀;（5）加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)這一步驟;（6）開蓋倒置，室溫晾干10 min，徹底晾干殘余的乙醇;（7）加入適量洗脫緩沖液TE，65 ℃水浴 10～60 min溶解DNA，期間顛倒混勻數(shù)次助溶，最終得到DNA溶液。用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測得到的DNA溶液。

1.2.3 ITS序列PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)的引物采用通用引物ITS1、ITS4[1，13]，PCR反應(yīng)所用的試劑是PCR Mix。25 μL的反應(yīng)體系如下：模板DNA 1 μL;PCR Mix 12 μL;ddH2O 10 μL;P1和P2分別為 1 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色觀察，檢測合格樣品進(jìn)行序列測定與分析。

1.2.5 序列分析 將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行BLAST比對檢索，從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取22種白粉菌ITS保守序列，采用Clustalx1.83將測序白粉菌（BC180623）結(jié)果與不同白粉菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，推演系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增的結(jié)果

ITS通用引物擴(kuò)增獲得的目的片段用膠回收試劑盒回收并純化，對所得結(jié)果進(jìn)行電泳檢測（圖1），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序獲得長度為603 bp的堿基序列，結(jié)果如下：2.3 百日菊白粉菌ITS序列進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果與分析

獲得的序列用NCBI的BLAST進(jìn)行序列搜索，從GenBank中選取部分植物白粉菌ITS序列與本試驗(yàn)測序結(jié)果進(jìn)行比較分析（表1）。對表1白粉菌的ITS序列對比分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知，樣品百日菌白粉菌BC180623的ITS序列與KF453969.1的ITS序列最為接近，相似度達(dá)到99%。兩者序列差異性主要體現(xiàn)在第2、4、19、560、581、585位堿基上。說明樣品百日菊白粉菌與KF453969.1具有較近的親緣關(guān)系。此外，23種白粉菌ITS序列219 ～374 bp之間保留著較高的一致性，因此，這些區(qū)段有可能起到了保障白粉菌性狀穩(wěn)定遺傳的功能。