玉米螟的分子連接性指數模糊聚類分析

趙昕 陳小穎 陳日曌

摘要：玉米螟危害多種作物，對我國玉米產量與質量的影響尤為明顯，我國作為農業大國，防治玉米螟至關重要。為進一步研究不同種類玉米螟生長發育歷程及習性，以達到更好地防治效果，利用遺傳多樣性分析和分子連接性指數模糊聚類方法對不同地理位置和不同寄主的玉米螟進行生物進化研究，分析玉米螟基于不同地理位置和不同寄主2種情況是否各自存在生物型分類。結果表明，在不同地理位置上玉米螟存在生物型分類，而在不同寄主上玉米螟不存在生物型分類。這一研究成果為玉米螟的分類研究和玉米螟防治提供了一種有效的方法。

關鍵詞：玉米螟;DNA序列;分子連接性指數;模糊聚類分析;遺傳多樣性

中圖分類號：S435.132?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0029-07

收稿日期：2019-03-08

玉米螟，別稱玉米鉆心蟲，屬鱗翅目螟蛾科，是一種世界性害蟲，在我國主要有亞洲玉米螟[Ostrinia furnacalis（Guenée）]和歐洲玉米螟[Ostrinia nubilalis （Hübner）]，其中亞洲玉米螟在我國是優勢種[1]。

玉米螟的分布非常廣泛，在我國除了西藏和青海等省份未見報道外，其他省份均有發生，其中黃淮平原和北方地區發生最為嚴重。玉米螟除了分布廣泛外，寄主植物的種類也很多，包括玉米、大豆、蔬菜等。相關調查結果顯示，每年我國有10多個省份的農作物都受到玉米螟的危害，減產幅度達到17.5%～51.0%。因此，玉米螟蟲的防治對于我國農業生產乃至世界農業生產都至關重要[1]。我國目前防治玉米螟的手段主要有化學防治、生物防治、農業防治等方法[2]。這些措施的綜合使用對玉米螟的防治雖然具有一定的效果，但還是沒有從根本上解決玉米螟的危害問題，大部分玉米螟依然繼續危害農作物。為更好地解決這一問題，國內外諸多研究人員把目光放在了對玉米螟的分類研究上，若玉米螟能夠得到有效的種內分類，即可更好地研究各個類別玉米螟生長發育習性，從而能夠對玉米螟進行針對性的防治，優化防治效果。

由于目前國內外針對玉米螟的種內分類尚無明確標準，因此本研究試圖利用模糊聚類方法對玉米螟的CO Ⅰ基因序列進行基于不同地理位置種群和不同寄主種群的遺傳多樣性和分子連接性指數聚類分析，探究玉米螟在不同地理位置和不同寄主上有無生物型分類。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取

本研究所用樣本是通過玉米螟性誘捕器捕獲的61個稈野螟屬玉米螟昆蟲（誘捕器主要為水盆式誘捕器和黏板式誘捕器），其中包括捕自不同寄主和不同地區的57個亞洲稈野螟屬玉米螟昆蟲和4個歐洲稈野螟屬玉米螟昆蟲（表1）。圖1為玉米螟樣本圖。

1.2 數據獲取

1.2.1 試驗器材與試劑 （1）器材主要有研磨機、離心機、DC-800渦旋混合器、水浴鍋、PCR儀、DYY-12C型電泳儀，滅菌的1.5 mL離心管和 2 mL 收集、移液器、紫外分光光度儀等。（2）試劑主要有Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取試劑盒、PCR引物、Mixture試劑，均購于吉林省庫美生物科技有限公司。

本試驗操作室為吉林農業大學中藥材學院分子實驗室。

1.2.2 基因提取 本研究所用數據為玉米螟的DNA序列，因此采用Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取試劑盒對玉米螟進行DNA提取。稱取單只玉米螟標本裝入1.5 mL離心管中，并裝入2顆小鋼珠，放入液氮中，5 min后取出，將離心管置于研磨機上研磨至標本粉碎，然后在12 000 r/min的離心機中離心 1 min;加入350 μL Buffer CTL和 25 μL OB蛋白酶，渦旋均勻，于60 ℃水浴箱中振蕩孵育30 min后，加入5 μL RNaseA混勻，于室溫下放置10～15 min，其他步驟參照Insect DNA Kit（50）D0926-01試劑盒說明。

完成操作步驟獲取DNA溶液，對溶液進行濃度測定后，進行基因擴增等后續步驟，以獲得CO Ⅰ基因序列。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 根據所要提取的COI基因片段進行PCR引物設計，上下游引物分別設計為YRS-1：5′-TTATCGCTTAAATCTCAGC-3′，YRS-2：5′-GACCTTCAAGTAGAAATCG-3′[3]。PCR反應體系和反應程序分別見表2和表3。

最后在4 ℃下保存PCR產物。對PCR產物進行電泳分析并在紫外分光光度儀下檢測其濃度。圖2為部分PCR產物電泳結果。

1.3 玉米螟遺傳研究

玉米螟的取食選擇具有多樣性，目前針對玉米螟寄主植物種類的研究較多，但對于玉米螟是否存在寄主分類的研究少之又少，本研究利用玉米螟COI基因探討玉米螟基于不同寄主和不同地理位置的分類。

1.3.1 采自不同地理位置的玉米螟種群遺傳研究 將玉米螟依據采集的地理位置不同劃分為美國、吉林長春、河南商丘、廣西南寧、湖北武漢、安徽合肥6個種群，討論玉米螟是否存在基于不同地理位置的遺傳分化。

由表4可知，除河南商丘種群外，其他5個種群內部無顯著遺傳差異（P>0.1），而河南商丘種群內部存在顯著的遺傳差異（P<0.01）。然后進一步分析固定指數（Fst）。

由表5可知，各地理位置種群間的Fst均大于025，表明不同地理位置的種群之間存在遺傳分化，之后利用聚類分析進一步驗證。

因此，以橫軸為樣本間遺傳距離（P），縱軸為堿基轉換距離（Ts）和顛換距離（Tv），構造散點圖，當序列間分歧逐漸變大，坐標點呈線性分布時，表示序列間替換尚未達到飽和，序列能夠進行后續的系統發育分析[3]。

本研究采用統計學中的回歸分析檢驗遺傳距離與顛換距離、轉換距離是否符合線性關系，使用MATLAB軟件編程計算所得CO Ⅰ基因堿基替換擬合結果見圖3。

1.4 堿基飽和度檢驗

利用分子生物學構建系統發育樹需要首先對堿基的飽和度進行檢驗，作為能否進行系統發育分析的判斷依據。若分子生物學分析顯示，分子數據不能構造系統發育樹，那么，統計學中的聚類分析缺乏前提保障，得到的聚類結果在生物學領域沒有意義，缺乏說服力。

生物學中的堿基飽和度分析與統計學中的回

歸分析一致，即分析堿基間的遺傳距離與堿基轉換（transition）和顛換（transversion）距離是否構成線性相關關系。其中，遺傳距離為多個性狀基因型值構成的多維空間的幾何距離，是評定物種間遺傳差異程度的指標;顛換為異型堿基的置換，顛換距離為序列對之間發生的顛換位點數與序列長度的比值;而轉換是同型堿基的置換，轉換距離為序列對之間發生的轉換位點數與序列長度的比值。其中堿基的類型分為2種，即嘌呤和嘧啶。

由圖3、表8可知，遺傳距離與堿基轉換距離之間呈線性關系（P=0.037 309 063），且擬合程度良好（r2=0.999 450 238），精確度高（標準誤差小）。

由上式可以得到61個樣本間的相似關系，從而得到模糊相似矩陣。

1.5.4 模糊等價矩陣的構建 由于“1.5.3”節中所求得的矩陣（R）是否具有傳遞性尚不明確，因此為了分類，需根據（R）構造模糊等價矩陣（R*）。本研究采用平方法構建（R）*。

當k使（R）2k=（R）2k+1時，此時的（R）2k即為所求的模糊等價矩陣R*，即（R）*=（R）2k。

根據求得（R）*后可知，在不同的分類水平（λ）上，所得到的截距陣不同，從而獲取的分類情況也不同。圖4為模糊聚類分析動態聚類譜系圖。

由圖4可知，不同的分類水平，有不同的分類數與之對應。當λ=0.998 2時，美國、吉林長春、河南商丘、廣西南寧、湖北武漢、安徽合肥6個種群都單獨聚在一起，即河南商丘種群包括8、11、24、61、23、30、35、52、27、28、39、49、53、56、60、57、12、44、22、37、46、42、47，美國種群包括1、2、3、4，吉林長春種群包括5、 33、18、32、59、51、17、31、20、29、41、9、58、10、13、21、45、34、7，廣西南寧包括19、36、38、54，湖北武漢包括6、48，安徽合肥包括14、40，當λ=0966 6時，樣本得到不同的國家分類，分為歐洲和亞洲2個類別，也屬于依據不同的地理位置范疇，說明各個不同地理位置種群之間具有種類區別。

2 結論與討論

對6個不同地理位置種群和4個不同寄主種群進行生物型分類研究，針對不同地理位置種群，遺傳多樣性分析結果顯示，除河南商丘種群外，其他5個種群內部無顯著遺傳差異現象，河南商丘種群種內存在顯著的遺傳差異，并且各個種群間的遺傳分化水平很大，聚類結果存在同一地理位置的種群均聚在同一分支的分類情況，表明不同地理位置種群存在生物型分類，形成這種現象的原因是不同地理位置的種群由于地理隔離需要適應各自的地理環境和生存環境，經過長時間的物種進化形成基于地理位置的種群差異。針對不同寄主植物種群，遺傳多樣性分析結果顯示，4個不同寄主種群內部也不存在遺傳差異現象且種群間遺傳分化水平低，說明種群內部基因交流現象頻繁，聚類結果中不同寄主的標本交叉存在，沒有將相同寄主種群聚為獨立分支，表明基于不同寄主的種群不存生物型分類。

參考文獻：

[1]崔 麗. 氟苯蟲酰胺和NK130102對亞洲玉米螟的分子作用機理研究[D]. 北京：中國農業科學院，2014.

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