溫腎醒腦方對血管性癡呆大鼠腦組織Nrf2-ARE信號通路的影響

胡久略，商 健，侯紫君，臧文華，卞 華，王 軍，

王三沆1,2，樊 赟1,2，張瓅方1,2

(1.河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，南陽 473004；2.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，南陽 473004；3.河南中醫藥大學基礎醫學院，鄭州 450046)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由于腦血管系統的病理改變導致的缺血性、缺氧缺血或者出血性腦損傷所引起的嚴重認知功能障礙綜合征。VD是繼阿爾茨海默氏病之后世界上第二常見的老年癡呆癥，約占所有癡呆疾病的15%～20%[1]。認知功能障礙被廣泛認為是癡呆患者表現的典型特征[2]，包括認知功能和運動功能缺失，功能域和記憶障礙。目前臨床直接用于VD治療的藥物較少，且相關的藥效學研究不系統。溫腎醒腦方在臨床上廣泛用于治療VD，實驗觀察溫腎醒腦方對雙側頸動脈結扎誘導的大鼠VD的改善作用及其抗氧化應激作用機制。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗藥物制備

(1)實驗藥物：溫腎醒腦方中附子、巴戟、桂枝、半夏、石菖蒲、赤芍、淫羊藿、生曬參、大黃、遠志、甘草均一次性購于河南省藥材公司，并經南陽理工學院中藥教研室鑒定。

(2)制備：全方(附子20 g、巴戟15 g、桂枝12 g、半夏10 g、石菖蒲12 g、赤芍15 g、淫羊藿10 g、生曬參10 g、大黃6 g、遠志10 g、甘草6 g。加水回流提取兩次,第一次加10倍水提取2 h,第二次加8倍水提取1.5 h,藥液過濾、合并濃縮至含生藥1 g/mL,4 ℃保存備用,用時稀釋適當濃度。

1.2 藥物和試劑

溫腎醒腦方藥材購于張仲景大藥房，經南陽理工學院中藥教研室鑒定為道地藥材。腦復康片：0.4 g/片(批準文號：國藥準字H13021787)，購自石藥集團歐意藥業有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、一氧化氮合成酶(NOS)試劑盒，均購買自南京建成生物工程研究所。H &E染色試劑盒，購自北京雷根生物科技有限公司。Trizol Reagent購自invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒、引物設計及RT-PCR試劑耗材，均購自Takara公司。組織蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑和LightShift Chemiluminescent EMSA試劑盒均購自ThermFisher Scientific公司。核因子NF-E2相關因子(Nrf2)、Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)、醌NADH脫氫酶(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、GAPDH抗體均購自Abcam公司。山羊抗兔的二抗、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒，購于碧云天生物有限公司。ECL發光液購自Merck Millipore公司，0.45 μm PVDF膜購自美國伯樂公司。牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

健康成年Wistar大鼠70只，雄性，清潔級，體重200～250 g，由河南省實驗動物中心提供。動物許可證號：醫動字第20-012號。

1.4 主要儀器

Morris水迷宮及實驗視頻分析系統，上海吉量軟件科技有限公司；多功能酶標儀，瑞典Tecan公司；StepOnePlus熒光實時定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；蛋白電泳凝膠儀，美國Biotech生物有限公司；凝膠成像系統，Bio-Rad公司；Leica TP1020生物組織自動脫水機、Leica EG1140石蠟包埋機、Leica RM2235全自動輪轉石蠟切片機，均是德國萊卡公司；高速低溫離心機，日本Hitachi公司。

2 實驗方法

2.1 分組、模型建立和給藥

根據“勞倦過度、房室不節”[3]和高脂飲食制作腎虛痰瘀模型[4-5]：每天在水深25 cm，水溫25 ℃，容積5 L的圓型玻璃缸內強迫大鼠游泳至無力而下沉時撈出以誘導勞倦過度；每只雄鼠與6只動情期雌鼠同籠，每天更換動情期雌鼠以誘導房室不節，共30 d。同時喂飼高脂飼料(高脂飼料組成：81.3%普通飼料、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、0.2%丙基巰氧嘧啶、10%豬油、5%白糖)20 g，火腿腸14 g，連用30 d。腎虛痰瘀模型建立成功后，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰臥固定在手術臺上，消毒后，頸正中切口，縱向切開皮膚及皮下組織，鈍性分離雙側頸總動脈，手術中注意避免刺激迷走神經。隨后用無菌手術線結扎雙側頸總動脈，觀察大鼠生命體征正常，再縫合傷口，放回籠飼養。其中假手術組僅分離頸總動脈后不結扎縫合傷口，放回籠飼養。大鼠造模清醒后給與自由飲水。

腎虛痰瘀VD模型建立成功按照隨機分組，每組10只：正常組、假手術組、模型組、腦復康組(0.15 g/kg)、溫腎醒腦方給藥組(高劑量組5 g/kg、中劑量組2.5 g/kg、低劑量組1.25 g/kg)。其中正常組、假手術組、模型組給予蒸餾水灌胃2 mL/d，灌胃給藥4周。

2.2 行為學實驗

灌胃給藥結束后，采用Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶功能。檢測指標包括定位航行實驗：記錄大鼠下水至站到隱藏平臺的時間(逃避潛伏期)，如果2 min還未找平臺，實驗者將其引導至平臺上停留15 s，逃避潛伏期記為2 min，連續進行5 d實驗；定位航行能力實驗檢測結束后，次日進行空間探索實驗，檢測大鼠2 min內在隱藏平臺所在象限的游泳總距離和跨越平臺的次數。

2.3 樣本收集

在空間探索實驗結束后，將大鼠麻醉后，腹主動脈取血，室溫放置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取處上清液保存-80 ℃；用生理鹽水灌注心臟后直至肝臟顏色變成白色后，用剪刀快速斷頭，迅速剝離完整腦組織。部分放入10%中性甲醛，部分迅速放入液氮過夜，第2 d放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 腦組織生化指標檢測

按照試劑盒說明書對SOD、MDA、GSH-Px、NOS指標進行檢測，運用多功能酶標儀進行檢測。

2.5 病理切片觀察

腦組織用10%中性甲醛溶液浸泡固定48 h，脫水，石蠟包埋，連續切片(5 μm)，H &E染色后，中性樹脂封片。在光鏡下觀察組織病理變化并拍照。

2.6 RT-PCR檢測mRNA

根據GenBank提供序列號設計與合成特異性引物:NQO1(NM_012580.2)、HO-1(NM_01258.2)、GAPDH(NM_017008.4)序列如表1所示。各組大鼠腦組織100 mg加入Trizol試劑，按照說明書進行總mRNA提取分離純化。按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。RT-PCR反應體系：2×TB Green premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。擴增結束后分析擴增曲線和溶解曲線，溶解曲線程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，記錄各組樣本擴增反應的Ct值，運用公式2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 大鼠引物相關信息Table 1 Primer related information of rats

2.7 Western Blot檢測

取各組大鼠腦組織100 mg加入蛋白裂解液進行勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清液，取10 μL稀釋用于BCA法蛋白定量。剩余的加入Loading buffer進行蛋白變性。取50 μg蛋白樣本上樣進行電泳分離，然后加入濾紙、PVDF膜和海綿，300 mA轉膜1 h。轉膜完后加入BSA封閉液，搖床上室溫封閉2 h。按照一抗說明書稀釋一抗，加入一抗，搖床上4 ℃孵育過夜。回收一抗后，加洗滌液3次，每次10 min。按照二抗說明書稀釋二抗，加入二抗，搖床上室溫封閉1 h。回收二抗后，加入3次，每次10 min。使用ECL發光液試劑進行蛋白檢測。

2.8 凝膠電泳遷移(EMSA)實驗

取100 mg腦組織采用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，取適量用于BCA法蛋白定量。對寡核苷酸單鏈進行生物素標記，經純化、變性、退火等操作后可獲取的雙鏈生物素標記探針。按照EMSA試劑盒說明書進行實驗，凝膠電泳遷移結合反應體系中10 μg核蛋白中含10×Binding buffer 2μL、poly(dI·dC) 1 μL、NP-40(1%)1 μL、EDTA(200 mmol/L) 0.2 μL、MgCl2(100 mmol/L) 1 μL，Glycerol(50%) 1 μL,生物素標記的雙鏈探針 20 fmol，超純水補足至20 μL。6%PAGE膠中進行電泳分離后，凝膠中的樣本濕法電轉至尼龍膜上，轉移后將膜在120 mJ/cm2紫外交聯60 s。封閉，抗體孵育，洗滌，加底物平衡，洗滌。加入ECL后在成像儀上顯影。

2.9 統計學處理

3 結果

3.1 溫腎醒腦方對認知能力改善情況

如表2所示，定位航行實驗中前2 d各組大鼠潛伏期沒有明顯差異。第3 d開始，VD模型組較正常組潛伏時間更長。第4 d與VD模型組比較，腦復康組和溫腎醒腦方高劑量組潛伏時間較短有顯著差異，有統計學意義。第5 d各給藥組與VD組潛伏時間都有顯著差異(P<0.01)。如表3所示，空間搜索實驗中，與正常組比較，VD模型組游泳的總距離和穿越平臺次數較少，有統計學意義；與VD模型組比較，溫腎醒腦方高劑量組和腦復康組穿越平臺次數和游泳的總距離都有顯著差異(P<0.01)。

表2 各組定位航行實驗潛伏時間比較Table 2 Comparison of latency time of positioning navigation experiments in each group

注：*P<0.05、**P<0.01，vs正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組。

表3 各組空間搜索實驗目標象限游泳總距離及穿過站臺總數比較Table 3 Comparisons of total swimming distance and total number of crossing platform in each group of space search experiment target quadrant

注：*P<0.05，**P<0.01，vs正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組。

3.2 溫腎醒腦方對腦組織生化指標的影響

如圖1所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px和NOS的含量明顯降低，同時MDA的含量顯著增加；與VD模型組，腦復康組和溫腎醒腦方各給藥組的SOD、GSH-Px和NOS的含量有一定程度的升高，同時MDA的含量顯著降低，且有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

3.3 溫腎醒腦方對腦組織中NQO1和HO-1 mRNA表達影響

如圖2所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織NQO1和HO-1mRNA的表達量顯著減少(P<0.01)；與VD模型組比較，腦復康組和溫腎醒腦方各給藥組的NQO1和HO-1mRNA的表達量有不同程度上的升高，且均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

3.4 溫腎醒腦方對腦組織Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表達的影響

如圖3所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織細胞核中Nrf2的蛋白表達量顯著降低；與VD模型組比較，腦復康組和溫腎醒腦方各給藥組的明顯升高。然而，大鼠腦組織細胞質中Keap1的蛋白表達量相反，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織細胞質中Keap1的蛋白表達量較高；與VD模型組比較，腦復康組和溫腎醒腦方各給藥組的明顯降低。同時，腦復康組和溫腎醒腦方高劑量組大鼠腦組織中NQO1和HO-1的蛋白表達量較高，與VD模型組比較。

*P<0.05，**P<0.01，vs 正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組圖2 溫腎醒腦方對腦組織中NQO1和HO-1 mRNA表達影響Fig.2 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the expression of NQO 1 and HO-1 mRNA in brain tissue

+、-分別表示組織蛋白表達(活性)的高和低；sham為假手術圖3 溫腎醒腦方對腦組織Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the protein expression of Nrf2,Keap1,NQO1 and HO-1 in brain tissue

3.5 溫腎醒腦方對腦細胞核中Nrf2-ARE結合活性的影響

如圖4所示，在正常組和假手術組腦組織中，Nrf2-ARE的結合活性存在，然而模型組中這種結合活性不明顯了。在給予溫腎醒腦方藥和腦復康后，結合活性增加，特別是腦復康和溫腎醒腦方高劑量給藥組最為顯著。

圖4 溫腎醒腦方對腦細胞核中Nrf2-ARE結合活性的影響Fig.4 Effect of Wenshen Xingnao decoction on Nrf2-ARE binding activity in brain nucleus

4 討論

VD作為一種的由于腦血管疾病導致腦組織損傷，認知功能障礙為主病理特征的臨床綜合征，至少20%的癡呆是由它引起的，僅次于阿爾茨海默病[6]。表現為視空間功能障礙、記憶力和學習能力下降，運動障礙等等[7]。雙側頸總血管結扎后大鼠的定位航行能力和空間搜索能力下降明顯符合VD癥狀，但是溫腎醒腦方干預后能夠改善提高這些能力，一定程度上改善了VD的認知障礙。

目前VD的發病機制研究主要與氧自由基、膽堿能系統、氨基酸神經遞質、神經細胞凋亡等相關。其中氧自由基產生是心腦系統缺血性致腦損傷的核心環節之一[8-9]。動物腦缺血會使得腦組織產生大量的自由基和過氧化產物，如MDA、過氧化脂質(LPO)，同時清除自由基和過氧化物的相關酶SOD和GSH-Px明顯降低。然而，給予腦復康和溫腎醒腦方后，腦組織抗氧化指標和腦組織病理情況的改善說明，溫腎醒腦方一定程度上能夠提高大鼠機體清除腦組織自由基的能力，改善腦組織損傷。

Nrf2是內源性抗氧化防御系統的主要調節因子，具有維持體內氧化和抗氧化平衡，抑制炎癥和細胞凋亡等作用[10]。Nrf2基因敲除小鼠對應激源的敏感性降低，氧化應激損傷明顯增加[11]。生理狀態下，Nrf2與Keap1耦聯穩定存在于細胞質中。Nrf2-Keap1信號通路是機體抗氧化的重要途徑之一，外來刺激引起Nrf2與Keap1發生解離，Nrf2進入細胞核內，與ARE的特異識別位點相互結合，啟動ARE增加下游抗氧化酶如(NQO1、HO-1)的表達和GSH的合成，增加細胞對氧化應激刺激的抗性。對Nrf2-ARE信號的激活且可以反向抑制Nrf2蛋白的降解，增加Nrf2蛋白的轉錄活性，進一步保護下游基因的表達[12]。然而，雙側結扎頸總動脈VD大鼠，Nrf2的表達較少，降低了下游NQO1和HO-1的表達，使得腦組織損傷的產生。溫腎醒腦方可能通過增加Nrf2進入細胞核內轉錄活性，啟動ARE調控的NQO1、HO-1的表達。NQO1表達量的增多，可以維持內源抗氧化物的還原性；HO-1表達量增加能夠產生更多血紅素，而血紅素有很強的抗氧化性。在這些酶的作用下，氧化應激被抑制，多余的ROS得到清除，最終實現體內氧化還原平衡，達到改善VD認知障礙的作用。

5 結論

根據內經“陽化氣，陰成形”的理論，認為VD發生的病機多為腎(陽)虛痰瘀而致，基于此，創制了溫腎醒腦方。溫腎醒腦方由經典名方四逆湯和地黃飲子化裁而來，具有溫腎助陽、祛瘀化痰、醒腦開竅之功。研究表明，溫腎醒腦方能夠通過Nrf2-ARE信號通路，升高SOD和GSH-Px，降低MDA、LPO，清除過多氧自由基，維持體內氧化還原平衡，改善雙側結扎頸總動脈VD大鼠的認知障礙。為“陽化氣，陰成形”理論在VD中的運用提供了科學依據。