HPLC-ELSD同時(shí)測定鮮竹瀝中單糖 雙糖的含量△

趙雯，洪挺，游媛，羅躍華，付輝政

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹Phyllostachysviridi-glaucescens(Carr.) A. et C. Riv.、凈竹PhyllostachysnudaMcClure及同屬的數(shù)種植物的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體，煮沸后加適量防腐劑制得，具有清熱化痰之功效，用于肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶、中風(fēng)舌強(qiáng)、痰涎壅盛、小兒痰熱驚風(fēng)等癥，為治療肺熱咳嗽的要藥[1-2]，也是用于治療痰熱咳嗽等常見呼吸病癥中藥大品種鮮竹瀝、復(fù)方鮮竹瀝液的主要原料藥，涉及23家單方鮮竹瀝生產(chǎn)企業(yè)和10家復(fù)方鮮竹瀝液生產(chǎn)企業(yè)。鮮竹瀝主要含有愈創(chuàng)木酚、氨基酸、木脂素、無機(jī)元素、酚酸、糖等類成分[3-8]。熊艷等[9]采用柱前衍生HPLC比較了傳統(tǒng)燒制法和回流提取法2種方法制備的淡竹瀝中游離氨基酸含量，結(jié)果回流提取法所得游離氨基酸總量較燒制法高出近12倍。李紅等[10]采用紫外-分光光度法測定了竹瀝中總酚的含量，結(jié)果竹瀝中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.045%。熊艷等[11]采用HPLC對鮮竹瀝口服液中愈創(chuàng)木酚的含量進(jìn)行測定，該方法簡單可靠，重復(fù)性好。陳碧蓮等[12]采用高效毛細(xì)管氣相色譜法對鮮竹瀝中愈創(chuàng)木酚的含量進(jìn)行測定，該方法簡便，重復(fù)性好，靈敏度高。高吾名[13]采用原子吸收分光光度計(jì)和氨基酸分析儀對5個(gè)不同產(chǎn)地相同時(shí)令出廠的竹瀝油中6種無機(jī)元素和氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果竹瀝油中6種無機(jī)元素和氨基酸含量因產(chǎn)地不同差異較大，但每種無機(jī)元素占6種元素總量的比例和各種氨基酸的分布比例卻有一定的規(guī)律。筆者在對鮮竹瀝生產(chǎn)加工企業(yè)調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，不少企業(yè)使用水煮、高溫蒸等方法代替標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的干餾法加工鮮竹瀝，甚至有的生產(chǎn)企業(yè)直接使用蔗糖進(jìn)行勾兌，嚴(yán)重影響鮮竹瀝及制劑質(zhì)量，而鮮竹瀝收載于1992年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥材》(第1冊)，該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下有以酪氨酸為對照的薄層色譜鑒別、pH、相對密度以及總固體質(zhì)控項(xiàng)目，無指標(biāo)成分含量測定項(xiàng)[2]，難以有效控制其質(zhì)量。加之鮮竹瀝制備工藝特殊，影響干餾工藝因素較多。因此，非常有必要對鮮竹瀝現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，保障產(chǎn)品的質(zhì)量，規(guī)范市場秩序。本課題組對鮮竹瀝化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，其中單糖和雙糖為鮮竹瀝中的主要特征成分，目前尚未見測定鮮竹瀝中單糖和雙糖的文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)收集了按標(biāo)準(zhǔn)干餾法制備的9批鮮竹瀝和按古法直火烤的方法制備的樣品以及采用高溫蒸、水煮方法制備的非標(biāo)準(zhǔn)方法樣品，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法同時(shí)測定上述樣品中單糖和雙糖的含量，以此考察不同加工方法制備的鮮竹瀝中單糖和雙糖含量差異，經(jīng)方法學(xué)考察，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可作為鮮竹瀝的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

LC 20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司)；Sartorius BT 25S型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

D-果糖對照品(批號：100231-201305，純度：99.4%)、D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201205，純度：99.5%)、蔗糖對照品(批號：111507-201303，純度：99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

鮮竹瀝來源：樣品1～9為銅鼓縣偉升實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；樣品10～13為青春康源制藥有限公司生產(chǎn)；樣品14為紅楓鮮竹瀝廠生產(chǎn)；蒸(高溫)、煮、直火烤為自制樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品適量，加水分別制成含D-果糖162.710 46 μg·mL-1、D-無水葡萄糖211.388 4 μg·mL-1、蔗糖218.761 6 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取鮮竹瀝樣品2 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

Luna?Omega SUGAR 100?色譜柱(250 mm×4.6 mm，3 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(85∶15)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃，ELSD漂移管溫度為70 ℃；N2流速為2.0 L·min-1。見圖1。

注：A.混合對照品；B.鮮竹瀝樣品；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖。圖1 混合對照品和鮮竹瀝樣品HPLC-ELSD圖

2.4 線性關(guān)系考察

取2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液5、10、15、20、25 μL，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，以對照品進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各糖類成分的線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 檢測限與定量限

取已知濃度的混合對照品溶液，逐級稀釋，按2.1色譜條件測定。信噪比為3∶1時(shí)，測得果糖、葡萄糖、蔗糖檢測限分別為0.10、0.30、0.15 mg·mL-1；信噪比為10∶1時(shí)，測得果糖、葡萄糖、蔗糖定量限分別為0.73、1.36、1.31 mg·mL-1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取按2.2項(xiàng)下方法制備的供試品溶液10 μL，在2.1色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積平均值分別為379 461、299 135、398 264，RSD分別為1.3%、1.7%和1.6%，表明方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(批號：20180822)的鮮竹瀝樣品6份，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)行分析測定，果糖、葡萄糖、蔗糖平均質(zhì)量濃度分別為5.403 6、6.391 2、6.236 6 mg·mL-1，RSD分別為1.3%、0.9%和1.7%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(批號：20180822)10 μL，分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積平均值分別為369 903、290 412、376 556，RSD分別為1.2%、1.8%和1.6%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取上述已測含量的鮮竹瀝樣品(批號：20180822) 1 mL，共6份，精密稱定，分別精密加入D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算平均加樣回收率，果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率分別為98.1%、97.5%、99.2%，RSD分別為1.3%、0.9%、1.1%，表明方法準(zhǔn)確度符合要求。結(jié)果見表2。

表2 鮮竹瀝3個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品測定

按擬訂的含量測定方法，測定17批鮮竹瀝樣品中3種糖類成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品的含量測定結(jié)果 mg·mL-1

3 結(jié)果與討論

選用了Prevail Carbohyrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Luna?Omega SUGAR 100?(250 mm×4.6 mm，3 μm)3根色譜柱，本次實(shí)驗(yàn)Luna?Omega SUGAR 100?(250 mm×4.6 mm，3 μm)色譜柱的分離效果最好。

比較了流動(dòng)相乙腈-水(75∶25)、乙腈-水(80∶20)、乙腈-水(85∶15)、甲醇-水(75∶25)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(85∶15)，結(jié)果以乙腈-水(85∶15)作為流動(dòng)相效果最好。

銅鼓縣偉升實(shí)業(yè)有限公司采用的標(biāo)準(zhǔn)干餾法與古法直火烤工藝一致。銅鼓縣偉升實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的9批樣品中糖總量為18.0～21.9 mg·mL-1，平均含量為20.1 mg·mL-1，與自制直火烤樣品中糖總量差異不大，且均檢出3種糖類成分。

青春康源制藥有限公司可能人為添加蔗糖。青春康源制藥有限公司生產(chǎn)的4批樣品中3批未檢出葡萄糖，且蔗糖含量異常高。

自制樣品中蒸(高溫)工藝制備的樣品3種糖類成分均未檢出，水煮工藝制備的樣品只檢出蔗糖，直火烤工藝制備的樣品均檢出果糖、葡萄糖、蔗糖。

4 結(jié)論

通過建立鮮竹瀝中單糖和雙糖的含量測定方法，可以對生產(chǎn)工藝蒸(高溫)、水煮以及人為添加進(jìn)行區(qū)分，具有專屬性。