沉默CDK6 對人卵巢癌細胞增殖和粘附的影響

段麗 王莉莉 顏瑩 王冠 邢焱玲 孫杰

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿﹑無早期臨床表現，并且缺乏有效的早期篩查和診斷方法，死亡率在婦科惡性腫瘤中高居首位。卵巢癌的治療手段主要是手術輔助化療和放療，近年，卵巢癌的治療方法正在突飛猛進地發展，但卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中仍居高不下。因此，發現有效治療卵巢癌的新型靶點成為迫切需要。

細胞周期的異常調控導致細胞過度增殖是人類腫瘤發生的重要原因之一，與腫瘤的發生密切相關[1-2]。其中，細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinases，CDK6）是哺乳動物細胞關鍵的細胞周期重要調控因子[3]。CDK6在人類大多數腫瘤中過度激活。研究表明胃癌﹑肝癌﹑前列腺癌中均過表達，也有研究顯示CDK6 在早期卵巢癌中表達促進了早期卵巢癌發生發展[4]。本論文擬采用RNA干擾技術，探討靶向抑制CDK6基因后對人卵巢癌細胞增殖和粘附能力的改變，為卵巢癌靶向基因治療提供了實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人卵巢癌HO-8910傳代細胞株購買自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院中心實驗室。CDK6基因的shRNA表達載體由獸醫生物技術國家重點實驗室保存，CDK6及β-actin引物由上海吉瑪制藥有限公司設計﹑合成。熒光RT-PCR試劑盒購自美國AB公司，FuGENE HD轉染試劑盒購自德國Roche公司。其它試劑均為進口分裝或國產分析純。本研究經過黑龍江省醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

本實驗室構建5條特異性shRNA和一條陰性對照（無關序列），由上海吉瑪制藥技術公司設計。將處于對數生長期的卵巢癌HO-8910細胞以每孔5×l05的密度接種24孔培養板。按Roche轉染試劑盒說明書操作。實驗共分7組：Ⅰ空白對照組（未轉染組）﹑Ⅱ無關序列轉染對照組（shNC組）﹑陽性轉染組（ⅢshRNA-264組﹑ⅣshRNA-347組﹑ⅤshRNA-608組﹑ⅥshRNA-775組﹑ⅦshRNA-818組）。轉染后36 h﹑48 h和60 h時分別收集提取各組細胞的總RNA。應用半定量RT-PCR技術檢測CDK6 mRNA水平，結果顯示在各組轉染后48 h抑制率最高，其中CDK6-shRNA-608的抑制作用最強。因此選擇檢測CDK6-shRNA-608干擾后48 h對HO-8910細胞增殖和粘附能力的影響。

1.2.1 MTT實驗檢測細胞增殖能力 實驗分為3組：Ⅰ空白對照組（未轉染組）﹑Ⅱ無關序列轉染對照組﹑ⅢshRNA-608轉染組。轉染后將各組細胞制備成5×105mL-1濃度的單細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板，每組細胞重復4孔。置于37℃﹑5%CO2的培養箱中培養。培養48 h后每孔加20 μLMTT（5 mg/mL，Sigma），繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，適度振蕩10 min，充分溶解結晶。調節酶標儀波長為490 nm進行檢測，OD值反映細胞的增殖情況。

1.2.2 細胞-Matrigel基質粘附實驗 根據BD公司Matrigel使用說明書進行。96孔培養板中每孔加入16 μL Matrigel，置37℃﹑5%CO2的培養箱中孵育l h，PBS液洗2遍，加入200μL 0.1%BSA，37℃孵育2 h，PBS液洗2遍。轉染后48 h，用胰酶消化各組細胞后以5×105mL-1濃度接種于包被Matrigel的培養板，37℃﹑5%CO2培養1 h后，用PBS液清洗未粘附的細胞2次，每孔加入100 μL含0.1%BSA的DMEM培養液和20 μL的MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h后，棄去孔中液體，加入120 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解結晶。檢測490 nm OD值。

1.3 觀察指標

轉染前后細胞內CDK6 mRNA的表達變化。通過檢測平均光吸收值（OD值）來反映轉染shRNA-608后48小時HO-8910細胞的增殖和粘附能力。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，2組數據比較采用非配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對細胞增殖能力影響的檢測結果

利用MTT法檢測OD490值來反映轉染shRNA-608后48小時HO-8910細胞的增殖能力。結果顯示，CDK6-shRNA-608轉染組的OD值明顯低于無關序列轉染組和空白對照組，表明CDK6-shRNA-608轉染組的細胞數量﹑增殖活性明顯低于其他兩組，差異顯著，具有統計學意義（P=0.0003，P＜0.05）。而無關序列轉染組和空白對照組之間差異無統計學意義（P=0.085，P＞0.05）。詳見表1。

2.2 對細胞粘附能力影響的檢測結果

應用MTT法測定與Matrigel基質粘著的三組細胞的OD值以檢測轉染shRNA-608后48小時HO-8910細胞的粘附能力。結果顯示CDK6-shRNA-608轉染組的OD值明顯低于無關序列轉染組和空白對照組，表明shRNA-608可顯著抑制卵巢癌HO-8910細胞的增殖，CDK6-shRNA-608轉染卵巢癌HO-8910細胞后，其與基質的粘附能力顯著降低，差異顯著，具有統計學意義（P=0.0004，P＜0.05）。而無關序列轉染組和空白對照組之間差異無統計學意義（P=0.137，P＞0.05）。詳見表1。

3 討論

卵巢癌以發病隱匿﹑無早期臨床表現﹑缺乏有效的早期篩查和診斷方法而成為女性重要的生殖系統惡性腫瘤。多數患者在晚期時才被發現，死亡率高，經過腫瘤細胞減滅術以及術后輔以化療后，部分患者出現病情緩解，但一部分患者表現出化療耐藥和病情進展或者復發。闡明卵巢癌的發生﹑發展機制，采用針對性的藥物治療﹑尋求有效的藥物治療靶點，成為科研人員關注的熱點問題。

研究發現，多種腫瘤均存在CDK6基因擴增﹑過表達或CDK6活性增強，包括鼻咽癌﹑膀胱癌﹑胰腺癌﹑食道癌和粘液纖維肉瘤等腫瘤[5-7]。進入21世紀以來，利用RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）進行人類疾病的治療已受到極大關注，包括病毒感染性疾病和腫瘤治療[8-9]。siRNA可以通過RNAi效應特異性地沉默靶向基因，shRNA是具有發夾結構的siRNA前體，將人工設計合成的shRNA的模板DNA分子通過質粒轉入細胞，在細胞內轉錄出shRNA可用于癌癥的治療[10-12]。本研究也同樣使用shRNA技術研究干擾CDK6基因對卵巢癌細胞HO-8910增殖和粘附能力的影響，初步證實shRNA可靶向沉默CDK6基因，進而顯著降低卵巢癌細胞的增殖和粘附能力。

表1 CDK6 shRNA 對人卵巢癌HO8910 細胞增殖和粘附影響檢測結果

綜上所述，沉默CDK6基因可抑制卵巢癌HO-8910細胞的增殖和粘附能力。CDK6與腫瘤的發生密切相關，有望作為腫瘤治療的靶點之一。