管碟法測定血清青霉素濃度的影響因素分析及實驗教學應用

王見之

（復旦大學基礎醫學國家級實驗教學示范中心，上海200032）

0 引 言

我校微生物實驗教學涵蓋多種微生物基礎實驗，例如細菌的染色檢查、人工培養、生化反應、藥物的抗菌作用、細菌性疾病的微生物學診斷、病毒學實驗方法、分子微生物學實驗方法等教學實驗［1］。該課程主要目的在于加深學生對醫學微生物學基礎理論知識的理解、掌握必要的技能、培養科學嚴謹的態度、訓練觀察和記錄實驗結果及整理分析實驗結論的能力。其中，細菌人工培養、藥敏試驗是基礎醫學乃至臨床醫學常用的實驗技術。但是目前兩種實驗在教學中仍有不足，可以通過改良進一步提高教學質量和學生投身科研實驗的興趣。

目前，我校微生物實驗教學中針對細菌的人工培養、藥敏試驗主要有以下課程安排：細菌在液體培養基中擴增在教學課程前由教師完成，學生在課堂上只需要劃線接種即可，然而細菌的人工培養從培養基的配制、細菌的接種、培養性狀的觀察都需要學生掌握。細菌藥敏試驗，即抗生素的抑菌試驗，是廣泛應用的實驗技術，應當為廣大醫學生所掌握，但是由于目前采用的藥敏試驗——紙片擴散法的教學方案雖然難度較小，但是實驗影響因素較多，難以獲得理想的培養結果，容易出現假陽性、假陰性結果，藥敏試驗結果可信度低，也打擊了學生進行實驗活動的積極性。

微生物管碟法是測定抗生素血藥濃度的常用方法。目前，管碟法可用于檢測商品藥物效價［2］、提取物抑菌試驗［3-4］、菌種抗性監測及選育等［5-6］。利用管碟法測定血藥濃度的準確性受多種因素影響［7-8］，本研究針對管碟法各個步驟中的常見影響因素，利用臨床上常用藥物青霉素作為測定對象進行分析，從而建立一種完善可靠的微生物測定法。本實驗探索簡單易行的細菌培養方法，在短時間教學過程中讓同學們掌握各種細菌人工培養的方法、練習多種接種方式、學會觀察培養性狀及實際應用等。

1 主要試劑與儀器

注射用青霉素鈉（生產批號F5092312）購自華北制藥股份有限公司；藤黃微球菌（ATCC9341）、抗生素檢定培養基Ⅱ號購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司；LB培養基、玻璃培養皿（高度約16～17 mm，直徑90 mm）、牛津杯（規格10 mm×8 mm×6 mm）、分光光度計（上海光譜儀器有限公司）由復旦大學基礎醫學院醫學實驗教學中心提供。

2 實驗方法

2.1 實驗環境和實驗材料的準備

實驗操作臺需要潔凈無抗生素污染，紫外消毒。所有的實驗器材均需滅菌處理。培養皿、牛津杯均為厚薄、大小、重量一致的標準產品。及時做好實驗菌種的傳代和定期檢查工作，發現菌種老化需及時進行純化、復壯。

2.2 待檢樣品制備

清潔級健康青年Sprague-Dawley大鼠（250±50 g，3月齡）8只和老年SD 大鼠（600±50 g，18月齡）8只，購自復旦大學實驗動物科學部。腹腔注射青霉素（1萬U／100 g體重）60 min后尾靜脈采血，于4℃冰箱靜置1 h，離心（3 000 r／min，10 min）取上清，放入-80℃冰箱保存待用。

2.3 管碟法基本操作步驟

依據《中華人民共和國藥典（2010年版）》管碟法測定［9］，選擇藤黃微球菌（ATCC9341）為質控菌種，擴增后存入4℃冰箱保存待用。取玻璃平底培養皿，無菌條件下倒平板，底層為20 mL抗生素檢定培養基Ⅱ號，菌層5 mL，四象限法放置牛津杯，杯內加入血清樣品。另配置青霉素標準液用于制作標準曲線。27℃環境下培養后測量抑菌圈的直徑，其中最大濃度青霉素標準液產生的抑菌圈直徑應處在18～22 mm之間。由于抗生素濃度的對數值在一定范圍內與其產生的抑菌圈直徑成正比，因此可根據直線擬合所得青霉素的標準曲線計算血清中的青霉素濃度［10］。

3 實驗結果及影響因素分析

3.1 青霉素標準液的配制

精確稱取注射用青霉素鈉，利用pH＝7.8的磷酸鹽緩沖液溶解、稀釋、校正后，配制濃度分別為102～106U／L的青霉素標準液。本實驗中測定對象是青、老年大鼠，體重介于200～700 g之間，而腹腔注射青霉素劑量為1萬U／100 g體重，血清青霉素濃度圍繞103～104數量級之間，同時有研究發現［11］，標準品溶液的配制是抑菌試驗不確定度的主要來源，因此設計青霉素標準液濃度范圍十分關鍵，這關系到回歸方程線性范圍的準確性。

3.2 細菌懸液的制備

取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面培養物劃線接種于營養瓊脂板上，27℃培養16～20 h，挑選2代單克隆菌種接種于LB培養基內，在27℃環境下搖床培養。實驗發現，當藤黃微球菌懸液擴增至OD600＞0.5時，培養時間適中且抑菌圈直徑大小較易測量，符合質控菌種的要求。細菌的濃度應當達到數量要求，否則后續培養時間會過長，抑菌環超出最佳數值范圍。

3.3 雙碟培養基的制備

（1）底層培養基。121℃，30 min高壓滅菌后的培養基，加注底層20 mL，均勻鋪滿平皿且無氣泡，溫度不應過低，控制在60～70℃，以免培養基在倒板過程中凝結成塊而無法使用。待凝固后進行下一步。

（2）菌層培養基。無菌條件下用微量移液器吸取細菌懸液適量，加入融化的抗生素檢定培養基Ⅱ號中，制成5 mL菌層。培養后對最大濃度標準液（106U／L）產生的抑菌圈直徑進行測量。結果顯示，菌液和培養基體積之比為1∶50時，抑菌圈最大直徑處在20 mm左右。菌層制備過程中培養基溫度會影響菌層的均勻攤布，有研究證實［8］，溫度過低培養基會提前凝固。室溫25℃左右時制備菌層，培養基溫度需要滿足以下兩個條件：①融化的培養基溫度不可超過50℃，過高可使細菌生長受限甚至導致細菌死亡而無抑菌圈；②不可低于45℃，過低導致菌液與培養基不能混勻，在培養基在底層上攤布不均勻，表面部分凝固、局部凹凸不平，產生的抑菌圈不規則，誤差增大。所以當菌液加入培養基混勻以后，應當盡快加注到底層培養基上并迅速轉動培養皿使菌層培養基均勻鋪滿整個底層培養基，若表面不平整則會導致樣本從牛津杯下緣流出導致實驗失敗。

3.4 加樣的影響因素

盡量使用自動放置器按照四象限法放置牛津杯，以使牛津杯之間的距離均等，避免距離過小導致抑菌圈相連。放置好的牛津杯應靜置15 min使其在培養基上沉降穩定，再用微量移液器向牛津杯中加樣。加樣量為20 μL時，可以得到直徑大小較為適中的抑菌圈，且不會出現牛津杯因為加樣量過多產生位移或者樣品從牛津杯滲出導致抑菌圈模糊的現象。由于不同的樣本中抗生素濃度不一致，加樣量大抑菌圈大，加樣量小抑菌圈小，所以加樣量的多少主要取決于每個牛津杯中抗生素單位數，不同的待檢樣本需通過預實驗來確定合適的加樣量。加樣過程中，移液器槍頭吸液不能有氣泡，樣本需一次加樣成功，滴加時注意加樣方向以及高度，不能掛壁或者漏到牛津杯外緣，最大加樣量不應超出牛津杯體積范圍，操作不規范均會導致實驗失敗。

3.5 雙碟培養時間及溫度對樣品檢定的影響

檢測不同培養時間對抑菌圈產生效果的影響，發現當27℃培養6～12 h時，抑菌圈清晰且最大直徑處于20 mm左右。如果培養時間過長，抑菌圈會出現邊界不清、抑菌圈相連難以精確測量的情況。培養時間過短，則菌層還未生長到可觀察的狀態，細菌抑制效果不明顯。培養時間及溫度的確定跟菌層中菌量多少、抗生素效價有關，所以在每次實驗前都需要預實驗來確定具體方案，并在培養過程中進行觀察，在適宜時間進行結果測定。

3.6 抑菌圈測量的影響因素

主要有游標卡尺測量和抑菌圈測定儀測量兩種方法。一般選用儀器測量以減小人為因素造成的誤差。記錄測量結果后進行藥物濃度計算和統計分析。

3.7 標準曲線與應用

根據已經確定的實驗條件按步驟操作，測得青霉素標準液產生的抑菌圈直徑。以樣品中青霉素濃度c（U／L）的對數為縱坐標，抑菌圈直徑d（mm）為橫坐標，繪制標準曲線。利用Microsoft Excel軟件計算回歸方程為lg c（U／L）＝0.10 d（mm）＋2.66，R2＝0.996，該方程的線性范圍為102～106U／L。利用已知條件進行大鼠血清樣品測定，可得到邊界清晰、大小適中的抑菌圈。測得青年大鼠血清青霉素濃度為（4 957.93 ±526.32）U／L，老年大鼠為（41 835.98 ±633.69）U／L（見圖1）。

圖1 青老年大鼠血清樣品中青霉素濃度的測定結果

4 教學實踐

細菌的人工培養和藥敏試驗是需要學生掌握的實驗技術。教學過程中發現，以往我校開展的實驗課由于經濟、師資、時間和空間成本的原因，預實驗通常只由實驗教師完成，課堂上同學只需劃線接種，學習紙片擴散法藥敏實驗，實驗結果不夠精確。本研究討論的管碟法是國際常用的抗生素微生物檢定法之一，針對管碟法中可能影響實驗結果的條件進行探討，總結出了一種完善可靠的實驗條件，并運用于教學實驗中。基于以上實驗條件，選拔一批對科研有興趣、學有余力的同學［12］，由實驗教師帶領進行了如下預實驗準備：樣本的制備，青霉素標準液的配制、實驗器材的滅菌、細菌的培養，雙碟的制備及標準曲線的制作。實驗開始前，教師對細菌培養的原理以及樣本制作、管碟法的步驟做了介紹，詳細講解了實驗影響因素以及實驗過程中的注意事項。而實驗中以教師指導、學生自主操作為主要教學方法。過程中指導學生進行結果分析，引導學生查詢資料，建立不同的疾病模型獲取實驗樣本、分析實驗結果中出現的各種問題的原因［13-14］。經過實驗準備、實驗操作、結果分析、資料查詢、實驗報告撰寫等使學生得到系統的鍛煉，如動物手術操作訓練、動物疾病模型的建立方法、儀器設備的使用以及細菌人工培養方法、抗生素的測定方法等，增強了學生生物安全以及動物倫理知識（見表1）。綜合以上同學的實驗結果來看，此實驗方案可行，整個操作過程規范，多組別的樣本制作、標準曲線可用，測得不同組別的樣本有差異性。

表1 管碟法應用于教學實踐后的學習效果

5 結 語

傳統微生物實驗教學中細菌人工培養多采用固體培養基培養，教師準備好菌群供學生接種，學生不能完全掌握細菌人工培養的各種方法，細菌的藥敏試驗又是醫學研究中廣泛應用的實驗技術，應當為廣大醫學生所掌握。本研究建立了一種較為完善可靠的利用微生物管碟法測定血清青霉素的方法，運用于教學實驗中，并致力于提高教學水平，在基礎實驗教學中培養學生的創新能力。由于實驗準備周期長，目前只能讓部分學有余力，樂于參與預實驗的同學受益，取得較好的教學效果。未來借鑒MOOC等先進教學理念［12，15］，將信息化時代的線上教學和傳統實驗的線下教學有機結合，全面覆蓋到教學實驗中，提高教學水平及效果。