鹽酸厄洛替尼基因毒性雜質液相色譜-質譜聯用分析方法學驗證

劉蘭畦，趙燕芳，謝含儀，王珊珊，陳相峰

(齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省分析測試中心, 山東 濟南 250014)

中國現階段人口老齡化發展十分迅速，越來越多的人口步入老年。隨著環境污染和生活壓力的加劇，老年人肺癌的發病率不斷增加[1-2]。肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人們健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[3-4]。肺癌的治療方法除了傳統的手術，還有化療、靶向治療、免疫治療以及中藥治療等。以靶向治療為例，治療的藥物需要經過嚴格的基因檢測，找到合適的突破靶點后才選擇合適的靶向藥物。鹽酸厄洛替尼[5-7]又稱特羅凱，是一種分子靶向治療晚期非小細胞肺癌的藥物，鹽酸厄洛替尼片通過抑制人體細胞內表皮生長因子上一種特定酶的活性從而達到抑制腫瘤生長的作用，對提高患者的帶瘤生存率和改善生存質量有很好的治療效果[8-11]。但是老年肺癌患者由于臟器功能衰退、代謝功能降低和其他疾病的增多，對藥物伴隨毒副反應耐受性較差，需要對患者所服用的靶向藥物進行基因毒性雜質檢測，來避免對服藥患者的二次傷害。基因毒性雜質是指能直接或間接損害DNA、引起基因突變或致癌的一類物質，鹽酸厄洛替尼在生產和儲藏過程中引入的雜質存在著一定的毒副反應[12-14]，給患者治療造成不良影響，有必要對其加以嚴格控制[15-18]。本文研究并建立了采用液相色譜-質譜聯用法測定鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質3-乙炔苯胺含量的方法，毒理學限值小于10×10-6[19]，能夠有效地用于對其中3-乙炔苯胺的質量控制。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

QTRAP 5500型三重四極桿串聯質譜儀、Thermo UltiMate 3000液相系統、Thermo Hypersil GOLD C8色譜柱(美國Thermo公司) ；KQ2202 型數控超聲波清洗機(上海楚柏實驗設備有限公司)；Mettle AB265-S 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 實驗材料

對照品3-乙炔苯胺純度98%(上海時代生物科技有限公司)；甲醇為色譜純(美國天地有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；鹽酸厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C8(100 mm×4.6 mm，3 μm)，進樣量，5 μL ，柱溫，35 ℃，流速，0.4 mL/min。流動相為甲醇和水，梯度洗脫：0～2 min，20%甲醇；2～6 min，95%甲醇；6～9.5 min，95%甲醇；9.5～12 min，20%甲醇。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，多反應監測(MRM)模式，正離子檢測，選擇離子對118→75、118→91；離子源噴射電壓5500 V，氣簾氣體(CUR)壓力40 psi(1 psi=6.895 kPa)，碰撞氣體(CAD)壓力Medium，溫度600 ℃，霧化氣(GAS1)壓力45 psi，輔助氣(GAS2)壓力50 psi，去簇電壓(DP) 40 eV，碰撞能量(CE) 37 eV。

2.3 溶液的制備

供試品溶液的制備：取供試品鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，過500目篩，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，即得。

對照品貯備液的制備：取3-乙炔苯胺對照品，精密稱定100.0 mg，置100 mL量瓶中，加入少量甲醇使其溶解，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mL含1 mg的3-乙炔苯胺的溶液。取上述溶液用甲醇逐級稀釋成濃度為1 mL含100 ng的3-乙炔苯胺溶液，配制100 mL，即得。

對照品溶液的制備：取對照品貯備液5.0 mL，精密量取，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mL含5 ng的溶液，即得。

3 分析方法驗證

3.1 專屬性驗證

取甲醇試劑作為空白溶液、供試品溶液質譜進樣，證明空白溶液、供試品溶液對被測物測試無干擾；并取供試品含雜質的混合溶液進樣。相應的二級全掃描質譜圖見圖1。結果表明，空白溶液、供試品中其他雜質對目標化合物的檢測無干擾，方法專屬性強。

圖1 對照品溶液、供試品溶液及供試品含雜質溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms for the control solution, test solution, and test product solution with the impurity

3.2 定量限及檢測限驗證

信噪比(S/N)在3～5的濃度為檢測限濃度，信噪比在10～15的濃度為定量限濃度，計算定量限濃度6針對應的信噪比的相對標準偏差(RSD)應小于等于10.0%。

精密移取對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成0.5 ng/mL的溶液，作為檢測限驗證濃度。

精密移取對照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成1 ng/mL的溶液，作為定量限驗證濃度。測試結果見表1、表2。

表1 檢測限實驗結果

表2 定量限實驗結果

結果顯示：該分析方法中3-乙炔苯胺的檢出限為1.0×10-6；3-乙炔苯胺的定量限為2.0×10-6，其定量限6針信噪比的相對標準偏差為6.08%，且小于10%。

3.3 線性范圍驗證

取對照品貯備液適量，分別用甲醇溶液逐級稀釋配制成濃度為1、2、5、6、10、20 ng/mL 的標準溶液，作為線性范圍驗證溶液。取上述溶液各5 μL進樣，記錄色譜圖。

結果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺在1.0～20.0 ng/mL 的質量濃度范圍內，線性方程為y=23 983.3x-5 594.8，線性相關系數R2= 0.999 4，呈現出良好的線性關系。

3.4 方法精密度驗證

取對照品溶液作為方法精密度測試溶液，連續重復進樣6次，記錄峰面積響應值,并計算相對標準偏差。結果顯示該分析方法中3-乙炔苯胺峰面積的相對標準偏差為1.13%，證明方法精密度高。

3.5 重復性驗證

取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為100% 濃度的測試溶液，作為重復性測試溶液，平行6份，各取5 μL進樣，記錄濃度測定值，并計算相對標準偏差，6份平行樣品待測物實測濃度相對標準偏差為4.74%。結果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺重復性好。

3.6 加標回收率驗證

取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.4 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為80% 濃度的測試溶液，配制3份；取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為100% 濃度的測試溶液，配制3份；取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.6 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為120% 濃度的測試溶液，配制3份，作為回收率測試溶液。計算添加3-乙炔苯胺含量的回收率及回收率的相對標準偏差，驗證測定結果與真實值的差異，來確定該分析方法能否獲得準確的測試結果。3-乙炔苯胺加標回收測試結果見表3。

表3 3-乙炔苯胺回收率測試結果

結果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺低、中、高的加標的回收率范圍為90.1%～106.1%，回收率相對標準偏差為5.1%，回收率測試結果良好。

3.7 樣品含量測定

將建立的方法學應用于對鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質3-乙炔苯胺的分析。分別取鹽酸厄洛替尼片3個不同批次作為樣品1、樣品2、樣品3，粉碎成粉末，過500目篩，精密稱定5.0 mg，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲2 min后，各取5 μL進樣。測定結果顯示，樣品1～3均未檢出3-乙炔苯胺。經加標回收率實驗，得到樣品中回收率在87.5%～104.5%之間，回收率結果良好，可見該方法可以應用到實際樣品的分析中。

4 結論

通過對上述各項指標的驗證，表明采用液相色譜-質譜聯用法測定鹽酸厄洛替尼中的基因毒性雜質3-乙炔苯胺的分析方法，專屬性強，靈敏度高，回收率好，方法準確、可靠，能夠達到藥物基因毒性雜質檢測的技術要求。