SPE-UPLC測定火鍋底料中9種合成色素*

2020-05-13 02:59:18董建民劉紅偉

廣州化工 2020年8期

王珂，任釗，杜瑞，董建民，劉紅偉

(河南省商業科學研究所有限責任公司，河南鄭州 450002)

火鍋因其風味獨特，食用方便及其食材眾多，深受廣大消費者喜愛。火鍋底料作為火鍋的基礎，對火鍋口感及質量有著至關重要的影響[1]。為了使火鍋底料色彩鮮艷，增加消費者食欲，部分餐飲企業會在火鍋底料生產過程中，添加人工合成著色素[2]。人工合成著色素是以苯、甲苯、萘等化工原料經過一系列有機反合成為含有偶氮鍵苯環或氧雜蒽結構化合物，其性能穩定、色彩鮮艷、成本低廉；含有一定毒性，人體造成傷害[3-5]。我國國家標準GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》對人工合成著色劑使用范圍和要求都做了嚴格的規定[6]，其中人工合成著色劑禁止在火鍋底料中使用。

目前，食品中合成色素的檢測方法主要方法是高效液相色譜[7-12]。火鍋底料基質復雜，油脂含量高，若采用國標GB5009.35-2016方法進行前處理，需要先出去油脂，然后在進行聚酰胺吸附或液液萃取提(赤蘚紅)取色素；但前處理步驟繁瑣，需要經過復雜的吸附-解析或液液萃取過程，會造成提取不徹底，回收率偏低，結果不準確，重復性差[13]。本文采用固相萃取小柱進行樣品凈化，超高效液相色譜進行定量分析。可同時測定火鍋底料中檸檬黃、日落黃、新紅、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、赤蘚紅、酸性紅、亮藍等9種合成色素含量的檢測。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

1290Ⅱ超高效液相色譜(配有二極管陣列檢測器)，安捷倫科技公司；ProElut PWA-2 SPE柱(150 mg/6 mL)，迪馬科技公司；CR22N/CR21N高速冷凍離心機，日立集團。

檸檬黃(98%，1ST2420)、胭脂紅(98%，1ST2416)、日落黃(98%，1ST2421)、誘惑紅(98%，1ST2412)、新紅(98%，1ST2413)、莧菜紅(98%，1ST2417)、赤蘚紅(98%，1ST2415)、酸性紅(98%，1ST2414)、亮藍(98%，1ST2422)，均為分析標準品，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈、乙醇，均為色譜級，北京迪馬科技公司；甲酸、乙酸、乙酸銨，均為分析純，阿拉丁試劑(中國)；實驗用水均為超純水。

1.2 標準溶液、提取液配制

準確稱取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、誘惑紅、新紅、胭脂紅、赤蘚紅、酸性紅、亮藍標準品各25 mg(精確至0.1 mg)，用純水定容至25.00 mL，配成1 mg/mL的單標儲備溶液。混合標準工作液：分別移取適量標準儲備液，用純水定容至10 mL，得到1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL混合標準工作液溶液。

提取液：移取乙醇80 mL，乙腈80 mL，水60 mL，氨水10 mL，混勻。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫35 ℃；

流動相：A為甲醇，B為0.02 mol/L的乙酸銨溶液(pH值為6.8)；流速為0.4 mL/min，測定波長為254 nm；掃描范圍200～600 nm；進樣體積為2.0 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 前處理

稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入提取溶劑15 mL，渦旋震蕩10 min，8000 r/min離心10 min，收集上清液；下層殘留物用15 mL提取液按照上一步驟重復提取1次。合并2次上清液，在40 ℃水浴條件下，減壓蒸餾至3 mL左右，加入甲酸3 mL待凈化。

ProElut PWA-2小柱使用前依次用5 mL甲醇，5 mL 10%甲酸水活化；將全部待凈化液上樣至小柱，利用重力作用使液體自然流出，棄去流出液。依次用5 mL 10%甲酸水、5 mL甲醇淋洗小柱，并用洗耳球吹干。最后用6 mL氨水-甲醇(15+85)洗脫，收集洗脫液。洗脫液于50 ℃下氮氣吹干，加入1.00初始流動相渦旋均勻后，過0.22 μm PTFE-Q濾膜上機。

2 結果與討論

2.1 液相色譜圖

圖1 9 種色素液相色譜圖

通過對液相條件優化，選擇最佳色譜條件，9種合成著色劑標準品色譜圖，樣品加標色譜圖以及樣品色譜圖如圖1所示。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取試劑選擇

火鍋底料在生產過程中，會加入大量的動植物油脂，而檸檬黃、日落黃、新紅等人工合成著色劑易溶于水，難溶于乙醇，不溶于油脂。采用純水做提取溶劑，由于樣品基質含有大量動植物油脂，部分被吸附在樣品基質中色著色劑不能被提取出來，影響檢測結果準確性。本實驗采用乙醇-乙腈-水體系作為提取溶劑，可以提高合成色素提取率，降低脂溶性成分對提取色素的干擾。在提取溶液中加入少量的氨水，可以增加色素在提取溶液中溶解度，增強提取效率。

2.2.2 淋洗液優化

在固相萃取淋洗過程中，分別對比5 mL 10%甲酸水+5 mL甲醇(A)和5 mL水+5 mL甲醇(B)兩種淋洗液對結果的影響。結果發現：除亮藍外檸檬黃、日落黃、新紅等8種合成色素在A/B兩種淋洗體系外，無明顯差別。亮藍在A淋洗體系下回收率比B體系下回收率高15%～20%左右。可能是由于：亮藍易溶于水，在酸性環境下，亮藍中的磺酸基團或羥基與小柱填料形成氫鍵并牢牢結合，而A淋洗體系中含有10%甲酸，B體系不含有。

2.2.3 濾膜、復溶液選擇

圖2 9種色素在不同過濾器/復溶液回收率

圖3 9種色素在不同過濾器中的色譜圖

分別考察了PES、Nylon、PTFE-Q三種材質過濾器；流動相(水相)、甲醇、50%流動相作為復溶液。9種色素在不同過濾器中的回收率及色譜圖如圖2、圖3所示。

由圖2可以看出：選用不同過濾器，采用不同復溶液定容，9種色素回收率差別很大。采用PTFE-Q過濾器，50%流動相復溶，回收率最高，9種回收率均在90%以上；但在此條件下(圖3F)，由于液相色譜溶劑效應影響，檸檬黃和新紅峰響應值低，峰寬特別大。圖3顯示了9種色素在不同體系下的色譜圖。其中檸檬黃和新紅用流動相定容，響應值最高；采用甲醇定溶響應值最低；采用50%流動相定容，峰寬特別大，但響應值低。綜合回收率以及色譜響應值等因素，選用流動相(水相)作為復溶液。在實驗中發現，選用PES作為過濾器，過濾之后濾器上會吸附很多紅色素，而PTFE-Q過濾器則沒有，對照圖2回收率圖，過濾器殘留的紅色素為赤蘚紅。因此，綜上所述采用PTFE-Q過濾器，流動相作為復溶液。

2.3 線性回歸和檢出限

對9種合成著色劑標準溶液進行測定采用峰面積定量，以峰面積對合成著色劑濃度(μg/mL)求得線性回歸方程。以基線3倍噪音(S/N=3)考察了9種合成著色劑的檢出限。線性范圍在1～50 μg/mL范圍內，線性范圍良好，滿足檢測需要。結果見表2。

表2 9種著色劑線性方程、保留時間、相關系數及檢出限

2.4 回收率和重復性

按照GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》要求，選擇某品牌牛油麻辣火鍋底料進行3個不同添加水平加標實驗，加標水平為：2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，每個加標水平重復6次。結果如表3所示。結果表明；方法回收率在82%～99%，相對標準偏差(RSD)在0.1%～3%之間，滿足實驗需求。