高通量篩選策略在細胞色素P450單加氧酶定向進化中的應用

李敏奇, 謝凌志, 陳永正, 袁偉成*

(1. 遵義醫科大學 a. 藥學院； b. 貴州省生物催化與手性藥物合成重點實驗室；c. 貴州省教育廳綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000 )

細胞色素P450單加氧酶是來源最廣泛的酶家族之一，普遍存在于原核生物和真核生物，并參與生物體內眾多代謝反應，如甾醇和萜類化合物合成與修飾[1]。P450單加氧酶具有催化活性混雜性的特點，可催化羥化反應，環氧化反應和脫烷基化反應等許多氧化反應(Scheme 1)，因而在生物催化和合成生物學領域展現出極具吸引力的應用前景。然而，目前P450單加氧酶在生物催化方面仍然面臨著許多瓶頸問題，例如：反應活性低、選擇性不高以及催化穩定性差[2]。20世紀90年代Arnold等開發了酶體外定向進化技術，并廣泛應用于許多生物酶催化性能的提升。通過定向進化可實現P450單加氧酶的催化活性、區域選擇性和立體選擇性等催化性能的改善，甚至可以改變P450單加氧酶的催化機制，實現更多非天然的生物催化反應[3]。

Scheme 1

在酶的定向進化過程中往往需要尋找一種有效的基因突變策略來建立一個豐富的突變體文庫，常用引入突變基因的方法有易錯PCR、定點飽和突變、DNA重組和DNA交錯延伸等。除此之外，由于突變體文庫樣本量巨大，針對特定酶催化反應的定向進化還需建立一個與之對應的高通量篩選策略，用于從龐大的突變文庫中快速和準確地發現優良突變體。傳統的GC和HPLC分析方法雖然準確性高，但其篩選效率低，成本高。P450單加氧酶催化的反應類型多、底物譜廣泛，導致了高通量篩選策略的差異性較大，如何建立一種高效的篩選策略是P450單加氧酶成功定向進化的關鍵。本文綜述了P450單加氧酶在定向進化過程中高通量篩選策略的最新進展。

1 比色法篩選策略

1.1 NAD(P)H比色法

目前已知的絕大多數P450單加氧酶是NAD(P)H依賴型，還原態的NAD(P)H在340 nm處有最大吸收峰，當其參與P450單加氧酶催化氧化反應后，轉化為氧化態的NAD(P)+，后者在340 nm有較弱的吸收值。因而，通過在340 nm處定量檢測NAD(P)H消耗量，即可反應出P450單加氧酶的催化反應活性(Scheme 2)[4]。2002年，Gianfranco等通過P450BM3催化不同類型的底物證實了這一策略可被用于高通量篩選[5]。同年，Arnold等運用此高通量方法對P450BM3催化的烷基羥基化活性進行定向進化，成功獲得了突變體P450BM3 139-3，其與野生型相比己烷羥基化的活性提高了35倍以上。作者以P450BM3 139-3為親本進一步進行定向進化，成功獲得了另一突變體P450BM3 1-12G，其對丙烷的周轉率相較于親本提高了12倍(Scheme 2a)。

P450單加氧酶在催化過程中存在解耦合反應，生成副產物過氧化氫，使得NAD(P)H的消耗沒有全部用于底物轉化，從而導致該高通量篩選策略會出現假陽性[8]。為了解決這一問題，Bornscheuer等使用AmplifluidRed為指示劑，通過辣根過氧化物酶(HRP)催化生成熒光素試鹵靈來定量過氧化氫的生成量，用于計算耦合效率，來提高篩選的準確性[9]。

1.2 對硝基苯酚比色法

對硝基苯酚比色法原理是基于末端羥基化產物為不穩定半縮醛，在室溫下發生氧化反應，生成黃色對硝基苯氧基離子，后者在410 nm處具有特征吸收峰(Scheme 3)。 Schmid等利用P450單加氧酶可催化脂肪酸替代底物對硝基苯氧基羧酸鹽(pNCA)末端羥基化生成半縮醛的反應，建立高通量篩選方法，通過比較P450BM3 F87A與野生型的催化活性，驗證其在篩選過程中的靈敏度與可行性?；谠摳咄亢Y選策略，Schmid等對P450BM3 F87A催化8-pNCA(辛酸的替代底物)羥基化反應進行定向進化，成功篩選到突變體P450BM3 F87A/L188K/A74G/R47F，其催化效率從不可檢測提高至8.8 s-1(Scheme 3a)[11]。隨后，對硝基苯氧基離子的篩選方法還被應用于其他P450單加氧酶的定向進化，改善P450單加氧酶對天然底物的催化活性、熱穩定性[12]、過氧化氫耐受性[13]、共溶劑耐受性，以及電子轉移效率[15]。

此外，Farinas等采用新型替代底物對硝基苯基醚(8-pNPE)建立高通量篩選方法，用于P450BM3催化直鏈烷烴羥基化的定向進化，作者運用此高通量篩選方法經過兩輪篩選，成功獲得突變體P450BM3 VIII2C9，其催化末端羥基化的活性相較于野生型提高了5倍(Scheme 4)[16]。

Scheme 2

Scheme 3

Scheme 4

Scheme 5

1.3 對硝基苯硫酚比色法

對硝基苯硫酚(pNTP)是一種黃色化合物，在450 nm處有特征吸收峰。pNTP可自發進攻環氧發生開環反應，形成無色的開環產物(Scheme 5)。Schwaneberg等首次利用pNTP建立高通量篩選策略，完成了對P450BM3催化苯乙烯環氧化活性的定向進化，成功篩選獲得突變體P450BM3 5F5184K，其相較于親本P450BM3 5F5不對稱環氧化活性提高2倍(Scheme 5a)[17]。

1.4 副玫瑰紅比色法

副玫瑰紅是一種紅色試劑，可與亞硫酸發生脫水縮合反應生成席夫堿，后者可與甲醛反應生成紫色的副玫瑰紅衍生物，該衍生物在540 nm處具有特征吸收峰(Scheme 6)。CYP102D1催化大豆黃酮鄰位羥基化與其催化的O-脫羰基化的反應活性存在線性關系(Scheme 6a)，從而可通過烷基化反應活性反映其雙羥基化活性。Kim等利用了這種特性建立了一種基于副玫瑰紅的固相高通量篩選策略，用于CYP102D1催化大豆黃酮鄰位特異性雙羥基化反應的定向進化，篩選獲得突變體CYP102D1 F96V/M246I，與野生型P450酶相比，突變體對大豆黃酮羥基化的反應產率從無法檢測提升到5.4%的產率。進一步的突變篩選獲得了突變體CYP102D1 G1，其可催化3-位羥基化反應，并表現92%區域選擇性，但是羥基化的活性仍然不高[18]。作者在突變體CYP102D1 F96V/M246I的基礎上進一步定向進化，最終篩選得到突變體P450102D1 M8，其羥基化活性相較于親本提升了23倍，區域選擇性大于80%(Scheme 6b)。

Scheme 6

1.5 4-硝基苯乙腈比色法

4-硝基苯乙腈(NpCN)是一類醌類、苯二酚(HQ)類和鄰苯二酚類化合物檢測劑，NpCN在氧氣與堿性條件下可與以上化合物發生加成反應生成有色產物，后者可在特定的波長下被定量檢測(Scheme 7)。 Schwaneberg等報道了基于NpCN的高通量篩選方法對P450BM3催化苯環原位雙羥基化反應的定向進化，成功篩選獲得了突變體P450BM3 AW2，其催化假枯烯二羥基化的活性相較野生型提升了70倍(Scheme 7a)[20]。

1.6 靛藍比色檢測

有些P450單加氧酶可催化吲哚發生3-羥基化反應，生成3-羥基吲哚，后者在氧氣條件下自發氧化二聚形成水不溶的藍色沉淀物靛藍，其在600～675 nm處具有特征吸收峰(Scheme 8)。 WU等基于細胞色素P450 2A6可催化吲哚羥基化形成靛藍的特性，以吲哚衍生物4-氯吲哚建立高通量篩選方法。經兩輪固相篩選，作者成功篩選獲得突變體P450 2A6 St9與野生型相比kcat/Km值提升了5倍，kcat提升了2倍(Scheme 8a)。 Turner等使用靛藍預篩P450cam飽和突變文庫，并成功獲得了突變體P450cam Y96M，實現了P450cam催化非吲哚類似物二苯甲烷的羥基化(Scheme 8b)[22]。

Scheme 7

Scheme 8

1.7 Purpald比色法

4-氨基-3-肼基-5-巰基-1,2,4-三氮唑(Purpald)是一種無色試劑，在氧氣存在時其可與甲醛發生成環反應，生成紫色的Purpald衍生物，后者在550 nm處具有特征吸收峰(Scheme 9)。 Arnold等利用P450可催化二甲醚脫甲基生成甲醛可進一步與Purpald發生顯色反應建立高通量篩選方法。基于該高通量篩選策略，作者先后分別對P450BM3催化丙烷羥基化和正辛烷羥基化反應的定向進化，成功篩選獲得活性改良的突變體P450BM3 9-10A；進一步篩選獲得突變體P450BM3 35-E11，其相較于P450 BM3 9-10A周轉率提高了6倍(Scheme 9a)[23]。隨后，作者進一步對P450 BM3 9-10A進行定向進化，成功獲得了突變體P450BM3 77-9H，對辛烷末端羥基化表現52%的區域選擇性(Scheme 9b)[24]。此外，Purpald分析法被運用于P450單加氧酶催化短鏈醇羥基化[25]和棕櫚酸末端羥基化的定向進化[26]。

Fasan等運用Purpald比色法發展了一種指紋圖譜分析策略，通過檢測甲醛的生成來報告反應的活性，結合底物與活性部位構象，建立反應性能、底物骨架和蛋白結構三者之間的指紋圖譜(Scheme 10)。作者利用P450BM3及其突變體催化甲氧基化探針驗證指紋圖譜策略可行性，并且發現突變體P450BM3 FL#62在催化5種非甲基化底物時均表現出了優異的催化活性和區域選擇性(Scheme 10a)[27]。在隨后對P450BM3催化不對稱氨基化活性進行分析時，進一步證實了突變體P450BM3 FL#62對于分子骨架較大的底物也表現出較高的氧化活性(Scheme 10b)[28]。

Scheme 9

Scheme 10

Scheme 11

Scheme 12

1.8 硝基藍四唑-吩嗪硫酸甲酯比色法

在吩嗪硫酸甲酯(PMS)存在下，硝基藍四唑(NBT)可與NAD(P)H發生反應生成不溶的藍紫色產物甲瓚(Formazan)，后者在580 nm處具有特征吸收峰(Scheme 11)[29]。Li等運用此篩選策略實現了對P450pyr不對稱羥化對映體選擇性和區域選擇性的高通量分析。作者利用脫氫酶將P450單加氧酶不對稱羥化的產物轉化為酮化合物，同時生成NADH，再利用NBT-PMS分析法間接測量NADH，進而可對羥基化產物進行定量分析。作者運用此篩選策略對P450pyr進行定向進化，成功篩選獲得了突變體P450pyr 11BB12，催化1-芐基吡咯烷不對稱羥化 (S)-立體選擇性從43%提升到65%，另一突變體P450pyr 1AF4A表現83%(R)-立體選擇性(Scheme 11a)[30]。

此外，Li等還利用NBT-PMS高通量篩選策略，成功獲得高立體選擇(98%)且高區域選擇性(99%)催化正辛烷次末端羥化的突變體P450pyr SM1。同時，作者也獲得了可催化苯丙烷次末端羥基化的突變體P450pyr SM2，其表現95% (S)-立體選擇性和98%區域選擇性(Scheme 12)[31]。

1.9 4-氨酰安替比林比色法

4-氨酰安替比林(4-AAP)是一種酚類檢測試劑，在過硫酸鹽存在時可與苯酚發生氧化反應，生成紅色的4-AAP類似物，后者在509 nm處具有特征吸收峰(Scheme 13)。Schwaneberg等將P450BM3催化苯氧基脂肪酸末端羥基化釋放苯酚的特性，與4-AAP比色法相結合建立了高通量篩選方法(Scheme 13a)。基于此高通量篩選方法，作者成功篩選得到突變體P450BM3 1E7，其對3-甲基二苯醚的羥基化活性較于野生型提高8.2倍(Scheme 13b)。除此之外，Schwaneberg等發現4-AAP篩選策略同樣適用于在苯環上原位羥基化而產生酚類化合物的高通量分析。

Scheme 14

Scheme 15

1.10 4-(4-硝基芐基)吡啶比色法

4-(4-硝基芐基)吡啶(NBP)是一種親核試劑，在堿性條件下自發進攻環氧發生開環反應，生成紫色NBP衍生物，后者在600 nm處具有特征吸收峰(Scheme 14)， Arnold等基于此反應建立了高通量篩選方法。作者通過比較突變體P450BM3 139-3與野生型P450BM3催化苯乙烯環氧化活性與其在600 nm處吸光值的關系，驗證該方法的靈敏度及可行性，證明了該方法可用于篩選高環氧化活性的P450單加氧酶突變體(Scheme 14a)[34]。

Scheme 16

Scheme 17

1.11 苦味酸比色法

苦味酸是一種親核試劑，可選擇性進攻16,17-環氧甾醇環氧部位發生開環反應，生成橙色苦味酸衍生物，后者在490 nm處具有特征吸收峰(Scheme 15)。Wang等基于此反應建立高通量篩選方法，用于對P450BM3催化的黃體酮環氧化反應進行定向進化，成功篩選獲得可催化黃體酮生成16,17-環氧甾醇的突變體P450BM3 5-B10(Scheme 15a)[35]。

1.12 底物/產物比色法

底物/產物比色法篩選策略是基于底物/產物之間存在明顯的紅移或者藍移現象而建立的一種篩選策略(Scheme 16)， Arnold等基于此特性建立了高通量篩選方法?；谠摳咄亢Y選策略，作者對P450BM3突變體P411催化的1-甲基吲哚卡賓插入反應進行定向進化，成功篩選得到了一個含有11個突變位點的突變體，其催化生成N-甲基-3-吲哚乙酸乙酯的轉換頻率和總轉換數分別為470 min-1和18000次[36]。

2 基于熒光分析篩選策略

2.1 試鹵靈熒光法

試鹵靈是一種熒光劑，激發波長和發射波長分別為530 nm和580 nm(Scheme 17)。Commandeur等利用P450BM3可催化7-烷氧基試鹵靈O-脫烷基化生成試鹵靈建立高通量篩選方法，對P450BM3的有機溶劑耐受性進行定向進化，成功篩選獲得了對甲醇、乙腈和異丙醇三種溶劑耐受性增強的突變體P450BM3 MT111和MT112(Scheme 17a)[37]。

2.2 2-乙?；讲⑦秽?Peroxyfluor-1熒光法

2-乙?；讲⑦秽?2-ABF)可與NAD(P)+發生環化反應生成強熒光產物，后者的激發波長和發射波長分別為421 nm和480 nm (Scheme 18)[38]。但此分析方法同樣存在因解耦合產生假陽性的問題，Takahashi等將2-ABF熒光法與Peroxyfluor-1分析方法(H2O2熒光檢測試劑)相結合建立高通量篩選方法。作者將該高通量策略用于對P450BM3催化的甾體羥基化反應進行定向進化，成功篩選獲得突變體P450BM3 F87A/A330W，實現了P450BM3對非天然底物甾體的高區域和立體選擇性羥基化(Scheme 18a)[39]。

2.3 ABTS熒光法

2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)是一種介體物質，在辣根過氧化物酶(HRP)催化下與H2O2發生反應生成熒光產物ABTS2+，后者的激發波長和發射波長分別為340 nm和414 nm (Scheme 19)。Hauer等采用雙酶級聯的篩選思路，利用P450單加氧酶催化脂肪酸末端羥基化得到的氧化產物與半乳糖氧化酶進一步發生氧化反應生成醛酸和H2O2的反應特性建立高通量篩選方法?；诖朔椒?，作者成功篩選獲得突變體P450 153A S453A相較于親本P450 153A G307A催化脂肪酸末端羥基化活性提升了0.16倍(Scheme 19a)[40]。

2.4 香豆素熒光法

香豆素熒光法是通過P450單加氧酶催化脫烷基化反應釋放熒光產物7-羥基香豆素，后者的激發波長和發射波長分別為405 nm和460 nm (Scheme 20)。Vlada等運用此篩選策略建立高通量分析方法用于對CYP116B3的進行定向進化，成功篩選得到突變體CYP116B3 74H10，其催化7-乙氧基香豆素O-脫乙基化活性增加240倍，另一突變體CYP116B3 70A0對7-甲氧基香豆素的O-脫甲基化活性增加13倍[41]。此外，Akira等基于此高通量篩選策略對P450moxA催化O-脫乙基化活性進行定向進化，成功獲得活性提升20倍的突變體P450moxA-Q37W/T115A/H132L/R191W/G294D，同時發現此突變體對催化與香豆素構象差異較大的底物(雙氯芬酸和柚皮苷)的活性也有明顯的提升(Scheme 20a)[42]。

Scheme 18

Scheme 19

Scheme 20

Scheme 21

Scheme 22

Scheme 23

Scheme 24

P450BM3可催化7-苯并氧-3-羧香豆素乙酯(BCCE)發生O-脫烷基反應生成熒光香豆素衍生物，后者的激發波長和發射波長分別為400 nm和440 nm (Scheme 21)。Schwaneberg等以此反應為基礎首次建立了基于流式細胞術的P450單氧化酶高通量活性分析平臺。經過一輪定向進化，作者篩選得到突變體P450BM3 DM-1，其較親本P450BM3 DM的催化活性增加7倍[43]。

2.5 吉布斯分析法

吉布斯分析法是一種通過酚類化合物自身偶聯或者與吉布斯試劑發生偶聯反應產生熒光或紫外可見吸收的分析法(Scheme 22)。Arnold等基于此建立高通量分析方法并用于對P450cam的定向進化，成功篩選獲得突變體P450cam M7-8H，催化萘羥基化活性相較于親本提升了20倍(Scheme 22a)[44]。

2019年，Schwaneberg等首次將多路毛細管分析法運用于P450單加氧酶催化異佛爾酮羥化活性的高通量分析(Scheme 23)。通過將該分析方法與NAD(P)H比色檢測法相比較，作者發現該高通量方法較NAD(P)H篩選法的篩選時間延長了4～6倍，但準確性得到了很大改善[45]。

質譜法是一類基于分子量測定的分析技術，Keasling等通過底物探針類似物的巧妙設計，成功將納米結構-引發劑質譜運用于P450單加氧酶催化活性的高通量分析。作者將該高通量篩選方法用于對P450BM3催化朱欒倍半萜羥基化反應的定向進化，成功篩選獲得了可催化朱欒倍半萜羥基化反應的P450BM3突變體F87A, F87G, F87I, F87P 和 F87G/A238G(Scheme 24)[46]。

Li等以底物的同位素標記探針設計為基礎，建立了高通量質譜分析方法，并用于P450pyr催化1-芐基吡咯烷不對稱羥基化的對映選擇性高通量分析(Scheme 25)。作者運用此篩選策略成功得到突變體P450pyrTM，與野生型P450相比，其對此底物不對稱羥化的(S)-立體選擇性從53%提升到98%，區域選擇性由90%提升到100%[47]。

P450單加氧酶的高通量篩選方法以紫外-可見比色法為主，NAD(P)H比色法盡管存在解耦合等問題，但仍然是應用最廣泛的高通量篩選方法。此外，通過反應設計，引入或消耗生色基團的高通量篩選策略也常用于P450單加氧酶的定向進化，但這些分析方法僅限用于末端羥基化反應或者廣義上針對生色基團鄰位C—H鍵的羥基化反應，如pNCA、pNPE、Purpald等。除此之外，熒光分析篩選策略在提升催化活性領域也有許多運用，如針對氫過氧化物的檢測以及熒光產物的檢測等。其他高通量篩選方法，如多路毛細管篩選策略和高通量質譜法，雖然準確性較高，但對分析設備具有較高的要求。然而，目前針對區域選擇性和立體選擇性的高通量篩選方法較少，而且這些高通量篩選方法的特異性強，通用性差。隨著對P450單加氧酶定向進化的不斷研究，將會產生更多的高通量篩選方法，總結和歸納這些策略有利于加快P450單加氧酶定向進化的深入發展，從而促進P450單加氧酶在生物催化領域更廣泛的應用。

Scheme 25