新型雙鹵代吡啶酰腙的合成及生物活性研究

雷渭輝, 劉向榮, 楊再文, 趙順省

(西安科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710054)

酰腙類化合物是一類特殊的Schiff堿類化合物，是由酰肼中伯胺氮原子與醛或酮的羰基發生親核加成反應縮合而成，其分子結構中含有生物活性基團(CO—NH—N=CH)，具有抗腫瘤、抗菌、消炎鎮痛、殺蟲、抑菌等多種生物活性，因此其在農藥與醫藥方面具有廣泛的應用前景[1-3]。其中，含吡啶類酰腙相比于只含苯環類酰腙往往具有更高的生物活性[4-5]。如曾凡付等[6-9]合成了含有芳香基團的酰腙類化合物，對菜粉蝶幼蟲具有較強的觸殺活性和胃毒活性，且其結構中含有吡啶環的酰腙體現出更強的殺蟲活性。另外，據文獻報道[10]，通過將鹵素引入到酰腙化合物中能有效提高化合物的生物活性，這是由于鹵素具有增加分子親脂性，從而提高對脂質膜滲透性，另外鹵素的電負性可以增加中心分子生物活性等特點[11]。因此，含鹵素酰腙化合物通常具有良好的生物活性[12-14]，并被廣泛用作殺蟲、殺菌劑。例如，梁芳珍[15]等合成了含溴元素的酰腙化合物5-溴水楊醛硫代雙酰腙，當其濃度為1%和0.1%時其對大腸桿菌、枯草桿菌及金黃色葡萄球菌具有一定抑菌性。5-氯水楊醛水楊酰腙相比于不含氯元素的水楊醛水楊酰腙對辣椒疫霉菌、煙草赤星菌和棉花枯萎菌均有較好的抑制作用。研究[16-17]合成了水楊醛-4-氯苯甲酰腙釩配合物以及2-硝基-5-呋喃苯甲醛-4-氯縮氨基脲酰腙，由于兩個化合物中均含有氯元素，兩個化合物均對錐蟲和利什曼原蟲有著較好的殺蟲活性。

綜上所述，若同時將吡啶環、鹵素以及生物活性基團(CONHN=CH)結合起來，實現3類活性基團的疊加，有望得到具有特殊生物活性的新化合物。

本文以2-氯吡啶-4-甲酸甲酯(1)和水合肼為原料合成了2-氯吡啶-4-甲酰肼(2)， 2與鹵代(F， Cl， Br)對苯甲醛反應得到3種新型雙鹵代吡啶酰腙[C13H9N3OFCl(3a)， C13H9N3OCl2(3b)和C13H9N3OClBr(3c)]，其結構經1H NMR，13C NMR， IR和元素分析表征。利用紫外光譜研究了3a～3c與ct-DNA的作用模式；采用熒光光譜研究了3a～3c與BSA的作用方式；通過瓊脂擴散法研究了3a～3c對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌的抑制活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-2型熔點儀；TU-1900型紫外分光光度計；LS-55型熒光光譜儀；Bruker Avance-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Bruker TensorⅡ型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片)；PE-2400-Ⅱ型元素分析儀。

ct-DNA, Sigma公司,生物純;BSA,北京百靈威科技有限公司,生物純；2-氯吡啶-4-甲酸甲酯，上海百舜生物科技有限公司；水合肼(80%)，天津富宇精細化工有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 2的合成

在圓底燒瓶中加入1 5.16 g(30 mmol)和無水乙醇(30.00 mL)，加熱攪拌使其溶解；加入80%水合肼(3.64 mL)，回流(80 ℃)反應3 h。冷卻至室溫，析出大量無色透明晶體，過濾，濾餅烘干，用無水乙醇重結晶得白色固體2，收率78%, m.p.172.01～173.31 ℃;1H NMRδ: 10.19(s, 1H, NH), 8.56～7.74(m, 3H, PyH), 4.67(s, 2H, NH2);13C NMRδ: 162.81, 151.34, 151.17, 144.29, 122.14, 121.05; Anal. calcd for C6H6N3OCl: C 42.00, H 3.52, N 24.49， found C 42.06, H 3.09, N 24.00。

(2) 3a～3c的合成(以3a為例)

在圓底燒瓶中加入2 0.17 g(1 mmol)和甲醇(10 mL)，攪拌使其溶解；緩慢加入4-氟苯甲醛107 μL(1 mmol)，加畢，回流(65 ℃)反應4 h。冷卻至室溫，析出大量白色固體，濾餅過濾，烘干得白色固體3a，收率82%, m.p.208.3～209.4 ℃;1H NMRδ: 12.15(s, 1H, NH), 8.62～7.75(m, 3H, PyH), 8.45(s, 1H, N=CH), 7.83～7.33(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 165.08, 162.61, 160.68, 151.32, 148.78, 144.49, 130.95, 130.02, 122.68, 121.72, 116.38; IRν: 3470, 1669, 1598, 1534, 1237, 1138 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OFCl: C 56.23, H 3.27, N 15.13, found C 56.35, H 2.61, N 14.85。

用類似的方法合成3b和3c。

Scheme 1

3b： 白色固體，收率81%, m.p.218.5～220.1 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H, NH), 8.64～7.78(m, 3H, PyH), 8.44(s, 1H, N=CH), 7.85～7.56(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 160.75, 151.33, 148.59, 144.41, 135.47, 133.28, 129.46, 128.97, 122.70, 121.73; IRν: 3443, 1687, 1589, 1540, 1291, 1165 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OCl2: C 53.09, H 3.08, N 14.29, found C 53.20, H 2.53, N 14.00。

3c： 白色固體，產率84%, m.p.228.3～228.8 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H, NH), 8.63～7.68(m, 3H, PyH), 8.42(s, 1H, N=CH), 7.83～7.71(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 160.76, 151.33, 148.68, 144.42, 133.62, 132.42, 129.67, 124.31, 122.70, 121.73; IRν: 3452, 1673, 1594, 1542, 1273, 1174 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OClBr: C 46.12, H 2.68, N 12.41, found C 46.16, H 2.09, N 12.12。

1.3 3a～3c與ct-DNA的相互作用

在參比比色皿中加入3 mL現配制的0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.9)，同時向樣品比色皿中加入等體積現配制的1×10-4mol·L-1化合物溶液，首先掃描基線，之后用微量進樣器分別向參比比色皿和樣品比色皿中加入50 μL 100 mg·mL-1的ct-DNA溶液，連續加入6次，每次間隔5 min，使其充分混合，掃描波長范圍為250～500 nm。

在溫度恒定為(25±0.1) ℃的水浴鍋中測定化合物與ct-DNA混合溶液的粘度。首先將25 mL的0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液加入粘度計中，記錄緩沖溶液流經毛細管的時間，清洗粘度計后，加入用緩沖溶液配制的濃度為1×10-4mol·L-1ct-DNA溶液25 mL，再次記錄ct-DNA流經毛細管的時間。最后加入等體積(50 μL/次)的濃度為1×10-4mol·L-1的化合物溶液，連續7次，記錄每次混合液流經毛細管的時間。每組做3次平行實驗，求平均值，由溶液的相對粘度公式作圖[18]。

1.4 3a～3c與BSA的相互作用

配制0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.2)，再用現制的Tris-HCl緩沖液配制1×10-5mol·L-1的化合物溶液和1×10-7mol·L-1的BSA溶液。取3 mL BSA溶液，加入到比色皿中，開始掃描，然后逐次向比色皿中加入等體積(30 μL/次)的化合物溶液，待樣品與BSA相互作用3 min后開始測試，連續滴加6次。激發波長為280 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.5 3a～3c的抑菌性能測試

利用瓊脂擴散法[19]研究了3種酰腙化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性。采用LB培養基，以DMSO作為空白對照組。用DMSO配制得到2 mg·mL-1的化合物3a～3c溶液，為確定3a～3c的最小抑菌濃度，采用二倍稀釋法將溶液稀釋至1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1。采用數顯游標卡尺測量透明抑菌圈的平均直徑。抑菌圈的平均直徑>8 mm，可判定有抑菌作用。

2 結果與討論

2.1 表征(以3a為例)

3a的1H NMR譜圖表明，δ12.15處的特征峰為3a的酰胺NH吸收峰，δ8.62～7.75處特征峰為吡啶環的吸收峰，δ8.45處特征峰為腙N=CH吸收峰，且NH和N=CH質子峰均為單峰，苯環特征峰位于δ7.83～7.33間。可看出3a以酮式結構存在。

3a的13C NMR譜圖表明，δ148.78處的碳原子為3a腙N=CH碳原子，酰胺C=O處碳原子位移由2中的δ162.81變為3a中的δ162.61。

表1 3a～3c與ct-DNA的結合參數Table 1 Binding parameters of 3a～3c with ct-DNA

3a的IR分析顯示，3470 cm-1處吸收峰屬于酰胺N—H伸縮振動峰，1669 cm-1處吸收峰屬于酰胺C=O伸縮振動峰，1598 cm-1處吸收峰屬于腙C=N伸縮振動峰，1534 cm-1處的吸收峰屬于吡啶環C=N的吸收峰，1237 cm-1處的吸收峰屬于酰胺C—N伸縮振動峰，1138 cm-1處的吸收峰屬于吡啶環C—N伸縮振動峰。

2.2 生物活性

(1) 3a～3c與ct-DNA的相互作用

以3a為例，3a與ct-DNA相互作用的紫外光譜圖如圖1所示，3a～3c的cDNA/(εa-εf)與cDNA關系見圖2。紫外光譜可以用來研究酰腙化合物與ct-DNA相互作用的方式[20]，若發生減色效應說明化合物是以插入的方式與ct-DNA相互作用。這是由于化合物本身存在的空π*軌道與ct-DNA發生耦合而填充部分電子，導致π-π*躍遷概率下降，從而出現減色效應；此外，由于化合物插入ct-DNA后，長鏈ct-DNA分子的“屏蔽”作用使得π平面的通光量減少，也會出現減色效應[21]。

由化合物與ct-DNA的結合常數Kb計算公式[22]，得到擬合直線，Kb即為直線斜率和截距之比，擬合結果列于表1中。

λ/nm圖1 化合物3a與ct-DNA作用的紫外光譜圖Figure 1 UV spectra of interaction between compound 3a with ct-DNA

從圖1可以看出，隨著ct-DNA濃度的增加，吸光度逐漸減小，3a在299 nm處出現減色效應。3b、 3c在305.5 nm、 308 nm處也出現了類似的減色效應，由此可以判斷3a～3c均是以插入的模式與ct-DNA相互作用。由表1可以看出，3a～3c與ct-DNA的結合常數依次為5.14×106、 1.87×107和9.93×106L·mol-1，可看出3a～3c與DNA的結合能力均較強[23]，并且3b的結合常數大于3a和3c，表明3b與ct-DNA的結合能力更強。

cDNA/10-4(mol·L-1)圖2 3a～3c的cDNA/(εa-εf)與cDNA關系圖Figure 2 Plot of cDNA/(εa-εf) against cDNA of 3a～3c

圖3為3a～3c的(η/η1)1/3與ccompound/cDNA關系圖。從圖3中可以看出，隨著3a～3c的濃度的增加，化合物與ct-DNA混合溶液的相對粘度升高，這是由于為了容納3a～3c， ct-DNA相鄰堿基對間的距離增大，雙螺旋長度增長，導致混合溶液的粘度增加[24]。說明3a～3c均以插入方式與ct-DNA作用，這與紫外光譜得出的結論一致。

(2) 3a～3c與BSA的相互作用

熒光猝滅分為靜態猝滅和動態猝滅，靜態猝滅是猝滅劑與BSA形成了復合物，而動態猝滅是兩者發生相互碰撞造成的，可用Stern Volmer和Lineweaver-Burk方程[25-26]來描述。

表2 3a～3c與BSA的動態熒光猝滅參數Table 2 Dynamic fluorescence quenching parameters of 3a～3c with BSA

表3 3a～3c與BSA的靜態熒光猝滅參數Table 3 Static fluorescence quenching parameters of 3a～3c with BSA

ccompound/cDNA圖3 3a～3c的(η/η1)1/3與ccompound/cDNA關系圖Figure 3 Plot of (η/η1)1/3 against ccompound/cDNA of 3a～3c

以3a為例，3a與BSA相互作用的熒光曲線和3a～3c與BSA作用的結合曲線圖分別見圖4和圖5。如圖4所示，隨著化合物濃度增大，熒光猝滅的峰形和位置基本保持不變，但熒光強度呈梯次下降，在340 nm左右發生熒光猝滅，說明3a與BSA發生了相互作用。3b，3c與BSA作用發生熒光猝滅的峰形和位置與3a相似。

假設兩者是動態猝滅的過程。根據Stern Volmer，對Q和F0/F進行線性擬合，擬合結果見表2。由表2可知，猝滅速率常數Kq大于最大動態猝滅速率常數(2×1010L·mol-1·s-1)，表明酰腙化合物與BSA的相互作用并不是由分子碰撞引起的，而是形成了復合物。

根據Lineweaver-Burk，以lg[Q]對lg[(F0-F)/F]進行線性擬合，得到圖5，斜率為n，截距為lgKA。擬合結果列于表3，可以看出，3a～3c與BSA均以近似1/1形成了復合物，表明酰腙化合物可以在生物體內被蛋白質運輸與儲存[27]。3a～3c與BSA的結合常數KA分別為1.87×103、 9.77×107、 9.37×104L·mol-1，KA(3b)>KA(3c)>KA(3a)，表明氯代酰腙化合物3b較其他兩種鹵代化合物3a和3c與BSA的結合能力更強。

λ/nm圖4 3a與BSA作用的熒光曲線Figure 4 The fluorescence curves of interaction between 3a and BSA

(3) 3a～3c的抑菌活性研究

表4為DMSO和3a～3c對4種細菌的抑菌圈數據，抑菌順序為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌。由表4可以看出，3a～3c相對于空白對照組均對4種細菌有一定抑菌能力。同一濃度下，3a對4種細菌的抑菌能力不斷減弱，3b對4種細菌的抑菌能力先增強后減弱，3c對4種細菌的抑菌能力不斷增強，且3a相對于3b， 3c的抑菌能力最強，這是由于在生物體內，含氟化合物對膜、組織等具有較強的滲透力，提高了含氟化合物在生物體內的吸收和傳遞速度[28]。同一化合物對不同細菌的抑菌效果不同，3a對大腸桿菌的抑菌能力最強，3b對枯草芽孢桿菌的抑菌能力最強，3c對銅綠假單胞菌的抑菌能力最強。隨著化合物濃度降低，3a～3c的抑菌能力不斷降低。在化合物濃度為2 mg·mL-1時，3a對4種細菌的抑菌圈直徑依次為10.97、 10.92、 10.90和10.89 mm。在化合物濃度為0.25 mg·mL-1時，3a～3c對4種細菌的抑菌圈直徑接近于空白對照組的抑菌圈直徑，因此3a～3c的最小抑菌濃度為0.25 mg·mL-1。

表4 DMSO和3a～3c對4種細菌的抑菌圈數據Table 4 The date of inhibition zones of DMSO and 3a～3c against four kinds of bacteria

lg[Q]圖5 3a～3c的lg[Q]與lg[(F0-F)/F]的關系曲線Figure 5 Plot of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] of 3a～3c

合成了3種新型雙鹵代吡啶酰腙(3a～3c)。 3a～3c均是以插入方式與ct-DNA產生相互作用；化合物與BSA通過靜態猝滅的方式形成復合物；3a～3c與ct-DNA， BSA的結合強度關系為：3b>3c>3a。 3a～3c對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌4種細菌均有一定的抑菌能力。其中3a對4種細菌的抑菌能力最強。