氟代二苯乙烯氨基酸的合成及性能

鄭林波， 趙孔娥, 朱芳芳, 胡曉松

(武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070)

伴隨著蛋白質科學研究的快速發展，天然氨基酸因其攜帶的功能基團有限，無法滿足化學、生物學研究對蛋白質結構和功能日益增長的特定要求。非天然氨基酸可以通過結構設計賦予它們多樣性功能基團，從而具備如熒光性能、光敏特性、氧化還原活性。非天然氨基酸已經在酶活性測試、蛋白質結構和蛋白質相互作用分析等方面發揮了一定作用[1-5]。例如，Peter等[6]實現了非天然氨基酸以基因編碼形式定點插入到蛋白質中，制得具備某些特性的非天然氨基酸的設想。此外，非天然氨基酸也可以通過化學合成法、體外生物合成法等方式摻入蛋白質結構內[7]。

熒光探針已經成為研究復雜生物學過程的有力工具之一，具有良好熒光性質且尺寸相對較小的非天然氨基酸熒光探針在生物學研究、病理研究等領域發揮了重要的作用。二苯乙烯熒光團具有π共軛有機體系，熒光量子產率較高，其物理、光學和電子性質可通過結構設計進行調節[8]，已被廣泛用于熒光探針的設計。Pradeep等[9]設計并合成了一系列含有二苯乙烯結構的熒光非天然氨基酸，可以用作pH和氧化還原反應刺激反應型熒光探針。Ilseung等[10]用紫外線照射含有二苯乙烯結構的無熒光的白藜蘆醇，獲得了一種新的、高熒光的光致異構產物，可用于生物成像和雙光子顯微鏡。

氟原子具有核磁共振活性的同位素19F的自然豐度為100%，具有很高的核磁靈敏度，其化學位移與化學環境密切相關，而且天然蛋白質中沒有氟原子存在導致的背景干擾，因此在氨基酸中引入氟原子后，可以利用它的氟譜研究含氟代氨基酸的蛋白質在不同時間尺度上的動態變化。

結合二苯乙烯熒光團優異的光學特性和氟原子的核磁探針屬性，在前期的二苯乙烯氨基酸的合成與性能研究的工作基礎上[11]，我們計劃在分子結構中引入氟原子，使其可以同時作為熒光探針和核磁探針用于相關生物學研究。

本文首先通過對4-碘-L-苯丙氨酸(1)的羧基和氨基分別進行保護得到甲基-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(4-碘苯基)丙酸酯(2)； 2與4-氟苯乙烯在3-苯基-2,4-戊二酮存在的情況下，通過Heck反應得到甲基-(E)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(4-(4-氟苯乙烯基)苯基)丙酸酯(3)； 3首先在LiOH的作用下脫去酯保護基，然后在HCl作用下脫去叔丁氧羰基保護基得到(E)-2-氨基-3-(4-(4-氟苯乙烯基)苯基)丙酸的鹽酸鹽(4, Scheme 1)，產率47.4%，其結構經1H NMR、13C NMR、 IR和MS(ESI-TOF)確證。并研究了4的光學活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀；UV757CRT型紫外-可見分光光度計；Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Triple TOFTM5600型質譜儀；G2-XS QTof型質譜儀；WAY型阿貝折光儀；LS55型熒光/磷光/發光分光光度計；ZF-7A型紫外分析儀。

4-碘-L-苯丙氨酸(Ark Pharm)；亞硫酰氯(上海秦巴化工有限公司)；二碳酸二叔丁酯(Aladdin)；N-甲基嗎啉(Innochem)；醋酸鈀(Aladdin)； 4-氟苯乙烯(Accela)；N,N-二異丙基乙胺(上海秦巴化工有限公司)；3-苯基-2,4-戊二酮(TCI)；三苯基膦(國藥集團化學試劑有限公司)。其余所用試劑均為化學純或分析純。

1.2 合成

(1) 2的合成

冰水浴冷卻下，將亞硫酰氯2.00 mL(27.40 mmol)緩慢滴加到1 1.60 g(5.50 mmol)的甲醇(10.00 mL)溶液中,滴畢，撤除冰水浴，回流反應2 h。減壓蒸除溶劑，粗產物用乙醚洗滌得白色固體4-碘-L-苯基丙氨酸甲酯，不經純化直接使用。

向4-碘-L-苯丙氨酸甲酯的二氯甲烷(8.00 mL)溶液中依次加入N-甲基嗎啉1.82 mL(16.50 mmol)和二碳酸二叔丁酯1.58 g(7.14 mmol)，氮氣保護，攪拌下反應5 h。減壓蒸除溶劑，殘余物用乙酸乙酯(100 mL)溶解，依次用飽和碳酸氫鈉溶液(60 mL)，飽和食鹽水(60 mL)洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體，用甲醇重結晶，收集濾液，蒸除溶劑得白色固體2 1.90 g，產率85.0%, Rf=0.50(石油醚/乙酸乙酯=3/1,V/V), m.p.75.1～76.9 ℃;1H NMRδ: 7.64(d,J=7.5 Hz, 2H), 7.30(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.06(d,J=8.0 Hz, 2H), 4.17～4.13(m, 1H), 3.61(s, 3H), 2.97～2.93(m, 1H), 2.82～2.77(m, 1H), 1.32(s, 9H);13C NMRδ: 172.35, 155.34, 137.41, 136.88, 131.55, 92.29, 78.30, 54.86, 51.82, 35.86, 28.07; IRν: 3346, 2964, 1738, 1686, 1526, 1441, 1367, 1291, 1252, 1222, 1166, 1057, 1002 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C15H20NO4I{[M+H]+}428.0329, found 427.9099。

(2) 3的合成

將N-(叔丁氧羰基)-4-碘-L-苯丙氨酸甲酯(2)405.23 mg(1.00 mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺和H2O的混合溶劑(DMF/H2O=1/1,V/V, 36 mL)中，加入3 mol%Pd(OAc)26.74 mg(0.030 mmol)，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)0.39 g(3.00 mmol)和6 mol%3-苯基-2,4-戊二酮10.3 mg(0.058 mmol)，氮氣保護下，加入4-氟苯乙烯244.28 mg(2 mmol)，于90 ℃反應4 h。加入乙酸乙酯100 mL，用飽和食鹽水(2×100 mL)，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗產物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V)純化得黃色固體3 245 mg，產率62.0%, Rf=0.35(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.99.3～100 ℃;1H NMRδ: 7.50～7.40(m, 4H), 7.13(d,J=7.32 Hz, 2H), 7.06(d,J=7.63 Hz, 2H), 7.05～6.99(m, 2H), 5.00(d,J=6.71 Hz, 1H), 4.65～4.54(m, 1H), 3.73(s, 3H), 3.24～3.10(m, 1H), 3.10～2.99(m, 1H), 1.44(br s, 9H);13C NMRδ: 171.26, 162.31, 154.06, 134.99, 132.50, 132.47, 128.66, 127.03, 126.97, 126.91, 126.38, 125.58, 114.69, 114.52, 78.96, 53.38, 51.22, 37.11, 27.29; IRν: 3361, 2983, 1749, 1687, 1599, 1514, 1444, 1367, 1304, 1165, 964, 542 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C23H26NO4F{[M+H]+}399.4624, found 399.4621。

(3) 4的合成

將化合物3 214 mg(0.54 mmol)溶于甲醇(4.0 mL)和四氫呋喃(12.0 mL)的混合溶劑中，于0 ℃緩慢滴加氫氧化鋰溶液14.0 mL(1.70 mmol)，滴畢，攪拌下反應0.5 h(TLC檢測)。滴加1 mol·L-1鹽酸至pH<3，蒸除有機溶劑，殘余物用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，旋蒸除溶得白色粗品。不經純化直接使用。

將粗品溶于1,4-二氧六環(6 mL)中，緩慢滴加12 mol·L-1鹽酸2 mL，滴畢，攪拌下反應2 h(TLC檢測)。旋蒸除溶，殘余物用二氯甲烷(2×40 mL)洗滌，蒸除溶劑得白色固體4 155 mg，產率90.0%, m.p.210～211 ℃;1H NMRδ: 7.68～7.62(m, 2H), 7.56(d,J=8.24 Hz, 2H), 7.29(d,J=8.24 Hz, 2H), 7.24(d,J=5.19 Hz, 1H), 7.22(s, 2H), 7.21～7.18(m, 1H), 4.14(t,J=6.41 Hz, 1H), 3.15～3.08(m, 2H);13C NMRδ: 170.20, 160.64, 135.93, 134.38, 133.62, 133.60, 129.88, 128.32, 128.26, 127.95, 127.93, 127.12, 126.55, 115.62, 115.45, 53.09, 35.38;19F NMRδ: -115.52; IRν: 3379, 3003, 2931, 1745, 1606, 1537, 1512, 1421, 1209, 1016, 962, 837, 696, 540 cm-1; MALDI-TOF-MSm/z: Calcd for C17H16NO2F·HCl{[M+H]+}322.1010, found 322.1015。

1.3 性能測試

(1) 熒光量子產率的測定[12]

待測溶液為1.0 μmol·L-1化合物4的DMSO溶液，標準溶液為2.0 μmol·L-1硫酸奎寧的0.1 mol·L-1硫酸溶液。吸光度使用紫外-可見分光光度計測試，利用熒光光譜儀測試溶液的發射光譜，然后計算發射峰積分面積。測得標準溶液和DMSO的折射率分別為1.3452和 1.4778。

(2) 紫外-可見吸收光譜的測定

用甲醇配制50.0 μmol·L-1化合物4的溶液，然后取3 mL于10 mm×10 mm螺口石英比色皿中用于測定，將ZF-7A手提式紫外分析儀固定在桌面上，作為光源，發射254 nm的光，實驗過程中需要避開自然光的照射。在環境溫度22 ℃下，照射比色皿中的溶液，光照一段時間后立即測定紫外-可見吸收光譜，并記錄光照時間；重復光照操作、測試，直至紫外可見-吸收光譜不再有明顯變化為止。

(3) 氟譜的測定

取化合物4 27.5 mg于10 mL樣品管中，加入5 mL氘代甲醇溶解配制成溶液，取氟譜內標三氟乙酸乙酯5 μL，加入1 mL氘代甲醇稀釋，然后，取150 μL內標溶液于已配制好的化合物4溶液中；最后，取3 mL加入內標之后的化合物4溶液于10 mm×10 mm螺口石英比色皿中用于測定，用固定在桌面上的ZF-7A手提式紫外分析儀作為激發光源發射254 nm的光，照射比色皿中的溶液。按設定的累計光照時間進行照射，每到一個時間節點，取樣0.5 mL于核磁管中，立即測定氟譜，且整個實驗過程中避開自然光的照射。

2 結果與討論

2.1 合成

初始原料為4-碘-L-苯丙氨酸，先后通過甲酯化保護羧基，叔丁氧羰基(Boc)酰胺化保護氨基，得到4-碘-L-氨基酸衍生物(化合物2)。原料中含有碘原子，可通過Heck反應構建二苯乙烯結構的乙烯橋。Wittig反應[13-14]、Heck偶聯反應[15-16]和Suzuki反應[17]是比較常用的幾種構建乙烯橋的方法，但文獻[18-19]表明Heck 反應產物的trans選擇性更好。化合物2是制備目標產物重要的中間體，其分離純化可以通過甲醇重結晶進行，總產率為85.0%。

二苯乙烯基熒光基團的構建通過化合物2與4-氟苯乙烯的Heck反應實現。本文使用醋酸鈀，3-苯基-2,4-戊二酮(配體)和N,N-二異丙基乙胺作為催化劑，產率較高(化合物3， 62.0%)，后處理簡單，僅需硅膠柱層析分離(或乙酸乙酯重結晶)即可。當使用本組前期工作所采用的以三苯基膦作配體，醋酸鈀、N,N-二異丙基乙胺作為催化劑的方案合成化合物3時，存在副反應多，分離純化困難，產率較低(產率17.8%)等問題，雖然此方法在苯乙烯與化合物2反應制備二苯乙烯氨基酸時效果很好(產率81.0%)。此外，反應體系的酸堿性以及配體、催化劑的用量都會對反應產生影響，如果加入過量的配體，則容易使催化劑發生聚集，生成沒有催化活性的鈀黑，因此反應過程中必須嚴格控制好配體與醋酸鈀的比例。最后一步是將化合物3分別在堿性條件和酸性條件下，對羧基和氨基進行脫保護即可得到目標化合物4(產率90.0%)?；衔?和4的IR譜圖中在964和962 cm-1處有強吸收峰，對應的是反式烯烴結構的=C—H面外搖擺振動特征峰；在730～650 cm-1處沒有觀察到順式烯烴中的弱、寬吸收峰，這進一步證實了雙鍵為反式結構[20]。

2.2 紫外-可見吸收光譜

圖1為化合物4的紫外-可見吸收譜圖。由圖1可知，化合物4在甲醇中吸收峰為296 nm和310 nm，在DMSO中的吸收峰為301 nm和315 nm。出現兩個吸收峰的原因在于，分子內存在不同類型的電子躍遷。溶劑效應的影響導致最大吸收波長和吸收強度產生了相應變化。

λ/nm圖 1 化合物4的UV-Vis譜圖Figure 1 UV-Vis spectra of 4

2.3 熒光譜圖和熒光量子產率

圖2為化合物4在DMSO中的熒光激發、發射譜圖。由圖2可見，4的激發波長、發射波長分別為314 nm、 355 nm，斯托克斯位移為41 nm。當乙烯基對位沒有氟原子取代時，其激發波長、發射波長分別為312 nm、 357 nm，斯托克斯位移為45 nm[11]。表1為化合物4的物理化學性質，其熒光量子產率為0.22，摩爾吸光系數為2.4×104cm-1·mol-1·L，當乙烯基對位沒有氟原子取代時，該化合物的熒光量子產率為0.17，摩爾吸光系數為5.2×104cm-1·mol-1·L[11]。由此可見，氟原子的引入使熒光量子產率增加，改變了化合物的熒光性質。

λ/nm

表 1 化合物4的物理化學性質Table 1 Physicochemical properties of 4

λ/nm

2.4 光致順反異構性

圖3為反式化合物4(50.0 μmol·L-1)甲醇溶液光致順反異構隨光照時間變化的紫外-可見吸收譜圖。由圖3可見，未進行光照射前，化合物4最大紫外吸收波長出現在296 nm處，光照實驗開始后，隨著光照時間的增長，296 nm處的吸收峰迅速變弱。當累計光照時間t=14 min時，251 nm處出現了一個新的吸收峰，其強度隨著累計光照時間增長而增強。當t大于80 min時，紫外吸收光譜再無明顯變化，即累計光照時間t=80 min時達到光穩態，此時出現兩個等吸收點，分別位于251 nm和293 nm。在相同條件下測試乙烯基對位沒有氟原子取代的二苯乙烯氨基酸的光致順反異構時，累計光照時間t=68 min時就達到了光穩態，兩個等吸收點分別為253 nm和295 nm。

根據化合物4光致異構轉變一級動力學擬合曲線(曲線略)，由文獻[19]方法計算得到反式轉變為順式結構速率常數k為0.026 min-1。前期工作對乙烯基對位沒有氟原子取代的二苯乙烯氨基酸的光致順反異構轉變進行了擬合[11]，計算得到k為0.046 min-1，這說明在相同條件下，無氟取代的二苯乙烯類氨基酸比有氟取代的二苯乙烯類氨基酸(化合物4)具備更快的轉變速率?；衔?中由于氟原子的存在，其參與形成的氫鍵有可能使二苯乙烯結構從反式轉變為順式的活化能變大，導致轉換速率降低。

2.5 光致順反異構氟譜

圖4為化合物4隨光照時間變化的氟譜。從圖4可以看出，在未進行光照之前，化合物4中氟原子的δ為-115.22，經過一段時間的光照后，δ-115.53出現一個新峰，對應的是順式異構體中氟原子的峰。且隨著光照時間的增長，新峰的強度也不斷增強。相對于核磁共振氫譜和碳譜，氟譜能夠更加清晰地反映順式/反式結構的變化，因此化合物4可以作為核磁探針用于蛋白質結構的生物學研究。

圖4 4因光致順反異構隨光照時間變化的氟譜Figure 4 Light time-dependant 19F NMR spectra of compound 4 due to trans to cis photoisomerization

設計并合成了一種新型氟代二苯乙烯非天然氨基酸(化合物4)，斯托克斯位移為41 nm，激發、發射波長分別為314 nm、 355 nm，產率為47.4%，熒光量子產率為0.22，具有較好的熒光性能。化合物4在甲醇溶液中存在光致順反異構現象，擬合得到的反式轉變順式構型的轉變速率常數為0.026 min-1。氟譜表明反式結構和順式結構中的氟原子的化學位移分別為-115.22和-115.53。因此我們可以通過光照來調控含有非天然氨基酸4的多肽或蛋白質分子的結構，并利用氟譜來研究這些大分子結構中4的片段所含乙烯橋的構象，從而可以探索這些大分子結構的構象與生理活性的關系。