吉西他濱類似物的設計、合成及體外抗腫瘤活性

徐廣凌, 張小怡, 王晨陽, 端木彥濤, 王幸幸, 李茹君, 從 梅*, 趙偉棟*

(1. 新鄉醫學院 a. 醫學檢驗學院； b. 藥學院，河南 新鄉 453003)

癌癥是威脅人類健康的重大疾病，已成為全世界最嚴重的公共衛生問題之一[1]。化療在癌癥的治療中起著非常重要的作用，是臨床治療癌癥不可或缺的方案之一。然而，由于化療藥物自身分子結構的局限，在臨床應用中面臨眾多挑戰[2]。如吉西他濱(Gem， Chart 1)，1996年經FDA批準進入市場，通過干擾DNA的合成發揮抑制腫瘤生長的作用，是治療晚期非小細胞肺癌、胰腺癌的一線藥物，也可用于乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等惡性腫瘤的治療[3]。然而，吉西他濱極易被肝臟和血液中的脫氧胞苷脫氨酶(CDA)脫去4-位氨基生成無活性產物2，2′-雙氟脫氧尿嘧啶核苷(dFdU, Chart 1)，導致其在人體內半衰期極短(<17 min)[3]。因此，臨床通常需持續的靜脈給藥或聯合用藥來維持其細胞毒性作用。然而，這又增加了藥物對身體正常組織器官的毒副作用，臨床表現為骨髓抑制、腎毒性、胃腸道反應等[3]。此外，吉西他濱為親水性藥物，難以通過自由擴散透過細胞膜，必須借助相應的核苷轉運體(如hENT)將其轉入細胞[3]。但這種轉運體在多數病人(>65%)體內表現為缺失或表達量低[4]，進一步限制了吉西他濱的藥效。此外，轉運體問題也是腫瘤細胞對吉西他濱產生耐藥的主要原因之一[5]。

Scheme 1

Chart 1

為此，研究人員對吉西他濱的結構進行了修飾和改造，取得了一定進展[6-7]。近年來，納米藥物遞送系統為克服吉西他濱類化療藥物存在的弊端提供了策略[8-9]。利用納米技術構建的小分子化療藥物遞送系統，通過增加生物膜的通透性，控制藥物釋放，延長血液循環時間，提高負載藥物生物利用度[10-11]；另外，腫瘤組織中血管豐富、血管壁間隙相對較寬、結構完整性差、淋巴回流缺失，納米顆粒可利用腫瘤增強的滲透和滯留效應(EPR)有效地蓄積于腫瘤區域，從而增強藥物在體內分布的特異性，提高化療效果及降低毒副作用[9]。Doxil是一種PEG化阿霉素脂質體，是最早批準的用于臨床治療的納米藥物[12]。Doxil可延長阿霉素的體內循環時間，并增加其在腫瘤部位的濃度，從而降低在正常組織中的濃度。例如，Doxil可以顯著地降低阿霉素的心臟毒性，并在多種惡性腫瘤疾病的治療中表現出與阿霉素類似的抑瘤效果[13]。Abraxan是一種白蛋白和紫杉醇結合形成的納米顆粒，既能保持紫杉醇的腫瘤治療效果又能避免傳統紫杉醇制劑Taxol因助溶劑Cremophor El而引起的毒副作用。研究表明[14]，給予相同紫杉醇劑量的Abraxane和Taxol， Abraxane在腫瘤部位的濃度較Taxol更高，即Abraxane能通過EPR效應更多的在腫瘤部位富集。

將藥物分子被動地包裹在載體中，除少數可能產生的疏水相互作用或靜電作用，藥物分子和載體之間通常沒有較強的作用力使之連接。因此，大部分藥物載體存在藥物包裹率低、易滲漏的問題，在制劑貯存階段以及體內循環時都有可能發生，特別是對于吉西他濱類極性藥物，很難直接將其包載在載體材料中構建納米遞送系統。

基于上述研究，本文將戊炔酸或正庚酸和吉西他濱通過酰胺鍵偶聯獲得目標化合物2a, 2b和3a, 3b(Scheme 1)，期望能發現一種制備親脂性吉西他濱衍生物的路線，并獲得高活性抗腫瘤的候選化合物，為臨床借助納米技術構建高穩定性、低毒性的藥物遞送系統奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SGWRX-4型顯微熔點儀；Bruker Ascend-400 MHz型核磁共振儀(CDCl3或CD3OD-d4為溶劑，TMS為內標)；Bruker 7-Tesla FT-ICR型質譜儀。

吉西他濱，>99%，阿法埃莎公司；1-羥基苯并三唑(HOBt)，99%，伊諾凱公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl)， 99%，麥克林公司；其余所用試劑均為分析純或化學純。

1.2 合成

(1) 5′-OH保護的Gem類似物(1)的合成

在干燥的圓底燒瓶中加入Gem 263.0 mg(1.0 mmol)和DMF 4.0 mL，攪拌使固體溶解;依次加入叔丁基二甲基氯硅烷602.4 mg(4.0 mmol)和咪唑273.9 mg(4.0 mmol)，反應至終點(TLC監測)。將反應液緩慢傾至蒸餾水(30 mL)中，用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并有機相，經無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：A=二氯甲烷/甲醇=100/3，V/V)純化得白色粉末1，收率63.3%, m.p.118～120 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.68(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.34～6.31(m, 2H), 5.70(d,J=7.6 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 4.00～3.97(m, 1H), 3.90～3.88(m, 1H), 3.81～3.77(m,1H), 0.94～0.90(m, 18H), 0.11(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 165.8, 155.6, 140.6, 122.0(t,J=258.3 Hz, CF2), 95.1, 84.5～83.9(m), 80.9～80.8(m), 70.0～69.6(m), 60.1, 29.7, 25.8, 25.5, 18.3, 18.0, -4.75, -5.29, -5.46, -5.45; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H39N3O4F2Si2{[M+H]+}492.2525, found 492.2521。

(2) 2a， 2b的合成(以2a為例)

在冰浴條件下，依次向圓底燒瓶中加入THF 2.5 mL， 4-戊酸59.2 mg(0.6 mmol)， EDCl 192.0 mg(1.0 mmol)和HOBt 135.4 mg(1.0 mmol)，反應30 min；加入中間產物1 244.2 mg(0.5 mmol)，攪拌下繼續反應24 h。旋蒸除溶，殘余物用水(15 mL)溶解，用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并有機相，經無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：B=乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)純化得化合物2a。

以正庚酸代替戊炔酸，用類似的方法合成2b。

2a： 白色固體，收率33.0%, m.p.97～99 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.43(br s, 1H), 7.60(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.43(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.35～6.32(m, 1H), 4.36～4.30(m, 1H), 4.05～3.95(m, 2H), 3.83～3.80(m, 1H), 2.75(t,J=7.0 Hz, 2H), 2.59～2.55(m, 2H), 2.02(t,J=2.8 Hz, 1H), 0.96(s, 9H), 0.91(s, 9H), 0.14～0.11(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 172.1, 163.1, 154.8, 144.1, 122.9(t,JC-F=259.5 Hz, CF2), 97.2, 85.1～84.4(m), 82.3, 81.5～81.4(m), 69.6～69.2(m), 59.9, 53.4, 36.1, 25.9, 25.5, 18.3, 18.0, 14.0, -4.8, -5.3, -5.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H43N3O5F2Si2{[M+Na]+}594.2607, found 594.2603。

2b： 白色固體，收率51.0%, m.p.49～51 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.08(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.34～6.30(m, 1H), 4.37～4.29(m, 1H), 4.03～3.95(m, 1H), 3.83～3.79(m, 2H), 2.48(t,J=7.4 Hz, 2H), 2.36(t,J=7.4 Hz, 2H), 1.68～1.63(m, 4H), 0.95(s, 9H), 0.90～0.87(m, 15H), 0.13～0.10(m, 12H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 179.4, 174.2, 163.0, 144.5, 123.1 (t,JCF=258.9 Hz, CF2), 96.7, 81.5～81.4(m), 69.7～69.2(m), 59.9, 37.6, 34.2, 31.4, 28.8, 28.7, 25.8,25.4, 24,8, 2.7, 22.5, 22.4, 18.3, 17.9, 14.0, -4.8, -5.3, -5.5; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H52N3O5F2Si2{[M+H]+}604.3414, found 604.3411。

(3) 3a, 3b的合成通法

在干燥的圓底燒瓶中加入中間產物2a或2b 113 mg(0.20 mmol), TBAF 0.50 mL(0.50 mmol)和超干THF 3.0 mL，攪拌下反應20 min。濃縮，殘余物經硅膠柱層析純化得產物3a或3b。

3a： 白色固體，收率58.1%, m.p.147～149 ℃;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.35(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.26(t,J=7.2 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 3.99～3.94(m, 2H), 3.83～3.79(m, 1H), 2.69(t,J=7.2 Hz, 2H), 2.54～2.50(m, 2H), 2.28(t,J=2.6 Hz, 1H);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 173.8, 164.8, 157.7, 146.0, 124.0(t,J=257.5 Hz, CF2), 98.3, 86.9～86.2(m), 83.3, 82.9～82.8(m), 70.4, 70.2～69.9(m), 60.3, 37.1, 14.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H15N3O5F2{[M+Na]+}366.0877, found 366.0872。

3b： 白色固體，收率55%, m.p.116～118 ℃;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.33(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.26(t,J=7.2 Hz, 1H), 4.34～4.26(m, 1H), 3.99～3.94(m, 2H), 3.83～3.79(m, 1H), 3.31～3.30(m, 1H), 2.45 (t,J=7.6 Hz, 2H), 1.68～1.62(m, 2H), 1.42～1.28(m, 6H), 0.91(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 176.0, 164.9, 157.7, 146.0, 125.2(t,J=257.2 Hz, CF2), 98.3, 86.8, 86.2, 82.9～82.8(m), 70.4, 70.2～69.7(m), 60.3, 38.2, 32.7, 29.9, 26.0, 23.7, 14.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H23N3O5F2Si2{[M+Na]+}:398.1503, found 398.1499。

1.3 生物活性測試

(1) 體外抗腫瘤活性

將腫瘤細胞制成單細胞懸液，注入96孔細胞培養板中，每孔約6000個細胞。置入細胞培養箱中，于37 ℃， 5%CO2條件下過夜培養。先用DMSO將測試化合物溶解到合適濃度，再用DMEM培養基稀釋到預設濃度。將96孔細胞培養板中的細胞培養基置換成含50 μM有效吉西他濱藥物濃度的培養基，相同條件下繼續培養72 h。然后將96孔細胞培養板中的含藥培養基置換成100 μL的CCK-8稀釋液(增強型CCK-8試劑盒，Beyotime Biotechnology, #C0042)， 37 ℃于細胞培養箱中孵育1 h，即刻用酶標儀于450 nm波長處讀取吸光度A值。設置相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照，計算各實驗組的細胞活力。用DMEM細胞培養基將合成的化合物作系列濃度稀釋(50 μM, 5 μM, 2.5 μM, 0.5 μM, 0.05 μM)，以上述CCK-8試劑盒測定藥物各濃度對腫瘤細胞的抑制活性，使用GraphPad Prism 7.0軟件，采用非線性曲線擬合方法計算藥物對腫瘤細胞的半數生長抑制率IC50值。

(2) 酶穩定性

用微量移液槍分別取150 μL含吉西他濱(100 μM)溶液或吉西他濱類似物3a(100 μM)的Tris-HCL緩沖溶液(pH 7.5, 50 mM)，加入96孔細胞培養板中，然后在每個孔中加入50 μL濃度為0.005 μg/μLCDA酶(Abcam #99441)，混勻后振蕩2 min。使用酶標儀在280 nm波長下，測定每孔在反應開始后第1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 20 min, 45 min時的吸光度值[15]。

2 結果與討論

2.1 體外腫瘤細胞增殖抑制活性

采用CCK-8法對化合物2a， 2b， 3a和3b的體外抗腫瘤活性進行了測試。結果表明，在高測試濃度下(50 μM)，化合物2a和2b對人胰腺癌細胞MiaPaCa2， SW1990， PANC-1和人乳腺癌細胞MCF-7細胞均無抑制活性。化合物3b與吉西他濱Gem表現出相似的腫瘤細胞抑制活性。化合物3a在MiaPaCa2， SW1990， MCF-7中均表現出較Gem更強的腫瘤細胞抑制活性。統計學分析(T-test)證實兩組結構差異顯著，P值分別為0.025， 0.044和0.035(圖1)。

圖1 目標化合物對4種腫瘤細胞的抑制活性Figure 1 Biological activities of target compounds on the four tumor cells

由圖1還可知，3a藥物組中MiaPaCa2， SW1990， PANC-1， MCF-7等4種細胞的活力分別為(10.35±1.34)%， (9.91±1.37)%， (32.41±5.33)%， (15.22±1.53)%，而對照組的4種細胞的活力分別為(19.01±2.08)%， (20.13±3.24)%， (35.72±2.78)%， (23.20±2.02)%。在PANC-1細胞中，3a較Gem表現出更高的細胞抑制率，但T-test結果顯示差異不顯著(P=0.61)。

此外，還測得3a對4種腫瘤細胞的IC50值均小于Gem組(表1)。而3b也顯現出與原藥吉西他濱相當的抗腫瘤活性。該實驗結果表明，模型藥物Gem在N4引入親脂性功能基團以后，有望保持或更好地發揮其抑制腫瘤細胞增殖的活性。

表1 化合物的體外抗腫瘤活性Table 1 In vitro antitumor activities of the compounds

2.2 代謝穩定性

文獻[3]報道吉西他濱臨床應用面臨最嚴重的挑戰是其極易被血液中大量存在的CDA氧化失活，導致代謝穩定性差。為探究3a表現出高抗腫瘤活性的原因，選擇3a和吉西他濱測定了CDA穩定性(圖2)。由圖2可見，3a的吸光度與CDA無關聯，而吉西他濱在CDA存在條件下的吸光度顯著低于無酶條件下的吸光度，證明吉西他濱易被CDA還原而不穩定，而3a則不受CDA影響，表現出更好的穩定性。

Time/min圖2 Gem和3a對CDA的穩定性Figure 2 The stabilities of Gem and 3a in the presence of CDA

借助羧酸類化合物，合成了具備高代謝穩定性的脂溶性吉西他濱衍生物(2a, 2b和3a, 3b)。體外抗腫瘤實驗表明，3a和3b具有抗腫瘤活性，尤其3a不僅在多個細胞系上顯現出強于吉西他濱的抗腫瘤細胞增殖活性，而且能對抗脫氧胞苷脫氨酶的作用，有望作為Gem的脂溶性前藥進行深度開發。