遺傳代謝病高危患兒175例串聯質譜篩查分析

厲廣栩，逯軍，谷春芳

中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，海口570208

遺傳代謝病(IMD)又稱遺傳代謝異常或先天性代謝缺陷[1]，是由于維持機體正常代謝所必需的某種酶、載體蛋白、膜或受體等編碼基因發生突變，導致基因編碼的相應產物功能發生改變，使機體的生化代謝過程發生紊亂，造成生化反應的中間產物異常蓄積或末端代謝產物生成不足，從而引起的一系列臨床癥狀和體征的一類疾病。IMD的致病機制不僅涉及氨基酸、糖、有機酸、內分泌激素、碳水化合物、金屬元素、核酸等物質在合成、代謝、轉運以及儲存等多方面出現多種代謝的紊亂，而且還包括某些有毒代謝產物在線粒體、過氧化物酶、溶酶體等細胞器內的異常積累。每一種IMD的發生盡管都比較罕見，但總體發病率并不低，目前報道發病率大約1/2 500[2]。本研究回顧性分析175例IMD高危患兒的串聯質譜技術檢測資料，以探討該技術在IMD高危患兒篩查中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1～12月就診中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院IMD高危患兒175例，男110例、女65例，其中嬰兒期(>28天至滿1周歲)46例，幼兒期(>1周歲至滿3周歲)73例，學齡前期(>3周歲至滿6周歲)33例，學齡期(>6歲至滿12周歲)18例，青春期(>12歲至滿14歲)5例。主要臨床表現：抽搐和抽動123例，黃疸13例，發育落后8例，肌肉疼痛和肌張力異常7例，意識障礙6例，嘔吐3例，頭痛和頭暈3例，貧血、低血糖、呼吸異常以及皮膚改變各2例，先天性心臟病、精神的異常、腹脹以及代謝性酸中毒各1例。納入標準：①有多發畸形、先天性心臟病、白內障等出生缺陷；②抽搐或抽動、智力運動發育遲緩或倒退、生長發育落后、精神異常、肌張力異常、共濟失調、哭聲尖高或無力、嗜睡或昏迷、呼吸異常；③進食(哺乳)困難、反復嘔吐、厭食、長期腹瀉、肝脾大、原因不明的黃疸；④難以糾正的酸中毒、高血氨、高乳酸、頑固性低血糖、原因不明的電解質紊亂、貧血；⑤皮炎、濕疹、色素缺失、毛發異常、尿異味。排除標準：①拒絕參與本研究者；②抽血困難無法完成檢查者；③病歷資料不全者；④已明確診斷腦性癱瘓、染色體病、腦外傷恢復期、病毒性/細菌性腦炎、格林-巴利綜合征恢復期、脊髓性肌萎縮癥等疾病所致運動、智力、語音等功能障礙者。175例患兒均接受血尿串聯質譜檢測，且該研究經過中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院倫理委員會批準，家長簽署知情同意書。

1.2 串聯質譜血液檢測 應用干血濾紙法取患兒靜脈血或者手指血，滴于專用濾紙片上，采集3個血斑，每個血斑直徑至少8 mm，血滴均勻自然滲透濾紙片，待血斑自然晾干后保存于標本袋內，4 ℃冷藏保存，由專職工作人員于7 d內送廣州金域醫學檢驗中心檢測。具體步驟：① 使用打孔設備在有血斑的濾紙上打孔，其孔直徑為3.2 mm，取下相等直徑的干血濾紙片(相當于3.2 μL全血)，放到96孔過濾板中。② 將每個孔中放入標準的日常工作液100 μL，在室溫下安放20 min，用來提取血片中的特定成分。③ 將每孔內的液體離心(離心機轉速1 800 r/min)轉移至另一96孔承接板中，氮氣65 ℃吹干。④ 每孔中加入60 μL衍生化試劑，振蕩1 min，Teflon膜密封，65 ℃孵育15 min進行衍生化反應。⑤ 氮氣65 ℃吹干孔內溶液；然后再加入100 μL流動相振蕩1 min，等完全溶解后吹干。⑥ 將96孔板用Agilent PlateLoc微孔板熱封膜機封膜，上機待測。⑦啟動工作站Analyst，平衡系統10 min進樣，應用SCIEX公司液質聯用儀3200MD檢測血液中的氨基酸及肉堿標志物水平。

1.3 串聯質譜尿液檢測 收集患兒的隨機尿倒入干燥、清潔的一次性尿杯中，將特定的濾紙片放入尿液中使其浸潤，將完全浸濕的尿濾紙片取出，使其在室內自然晾干。尿液標本由專職工作人員于7 d內送往廣州金域醫學檢驗中心，應用島津(Shimadzu)公司的GCMS-QP2010Ultra檢測尿液中有機酸標志物水平，具體方法保密。

1.4 IMD的診斷及治療 IMD的診斷主要根據串聯質譜血液結果，結合臨床表現、常規實驗室檢查及尿液串聯質譜檢查結果綜合考慮，最終可通過基因檢測明確診斷，診斷標準相關參考文獻[3，4]。有機酸代謝障礙的治療藥物主要是左卡尼丁100～300 mg/(kg·d)分3次口服外，還給予核黃素(100～300 mg/d，分3次應用)。食用專用奶粉，同時外加蛋白質滿足賴氨酸、色氨酸的生理需求量。定期隨訪(電話或門診隨訪)并監測神經系統和生長發育情況。

2 結果

2.1 175例IMD高危患兒串聯質譜檢測情況 175例患兒中，發現代謝異常27例(異常率15.43%)；男16例，女11例；其中嬰兒期6例，幼兒期16例，學齡前期5例。27例異常最終確診為戊二酸血癥Ⅰ型(GA1)1例，確診率0.57%。其他異常26例中，氨基酸異常23例，包括氨基酸降低16例(甲硫氨酸降低7例、瓜氨酸降低3例、合并2種及以上氨基酸降低6例)，氨基酸增高7例(苯丙氨酸與酪氨酸的比例增高4例，谷氨酸、脯氨酸和亮氨酸的增高各有1例)；酰基肉堿異常有3例(3-羥基異戊酰肉堿增高、丙酰肉堿與乙酰肉堿比例增高和多種酰基肉堿增高各1例)。

2.2 GA1患兒異常表現 患兒女性，年齡1歲11個月；出生史無異常，血液生化檢查無異常，主要癥狀為腹瀉、抽搐，幼兒期起病；頭顱MRI顯示雙側放射冠及額顳葉的皮層下可見呈斑片狀的異常信號；動態腦電圖顯示異常，表現為夜間睡眠期為主，多次陣發出現中高-超高波幅5～6 Hz復合慢活動，間雜以尖波、尖慢波發放點為主，雙側同步對稱。串聯質譜(血)戊二酰肉堿0.78 μmo/L，串聯質譜(尿)戊二酸-2 525.8 μmol/L。基因檢測發現復合核苷酸變異。GA1患兒基因報告及家系來源驗證情況見表1。

表1 GA1患兒基因報告及家系來源驗證情況

注：c.271+1G>A(編碼區第271號核苷酸后內含子中第1位核苷酸由G變為A)的雜合核苷酸變異，為剪切變異；c.938G>A(編碼區第938號核苷酸由G變為A)的雜合核苷酸變異，該變異導致第313號氨基酸由Arg變為Gln(p.Arg313Gln)。

3 討論

IMD是一種先天性代謝障礙疾病，累及神經、肌肉、內臟、骨骼和皮膚等全身各個系統和器官，具有不同的臨床表現，其危害往往在于影響生命器官，尤其是大腦的發育及功能障礙、致殘，甚至危及生命，嚴重影響到兒童的健康和社會人口的質量。IMD患兒的最佳臨床結局取決于早期識別出IMD的臨床表現、及時評估病情并給予及時診治，其中實驗室檢查對正確診斷極為重要。1991年，美國人Millington第一次應用串聯質譜技術篩查IMD，隨后其他多個國家不斷運用。串聯質譜血液檢測因能夠篩查出有機酸代謝異常、氨基酸代謝異常和脂肪酸代謝異常等疾病，現在已是篩查IMD的主要手段。目前，我國已有100多家醫院引進串聯質譜技術用于臨床檢測和科學研究，使得許多IMD患兒得到及時診治。

本研究175例IMD高危患兒經串聯質譜血液篩查，代謝異常27例(異常 15.43%)，確診CA1患兒1例(確診率0.57%)。與以往報道[5]相比，CA1確診率不高，考慮與以下因素有關：① IMD篩查的高危因素擴大；②部分患兒未完善串聯質譜尿液檢查，串聯質譜血液檢測未見異常的148例不能完全排除IMD，考慮存在假陰性的情況；③ 地理環境、樣本量小、篩查誤差等因素的影響。本研究確診了1例IMD為GA1，屬于少見的一種常染色體隱性遺傳病。GA1的發病機制是由GCDH缺乏引起的GCDH活性障礙，由戊二烯輔酶A向戊烯輔酶A轉化的過程被阻斷，導致體內相應的氨基酸不能進一步被分解，使得過量的相應的中間產物如戊二酸、3-羥基戊二酸和戊烯二酸等在體內的組織中和體液中蓄積。GA1很少發生在新生兒期，如果在出生時發病，通常表現為腦小型大頭畸形，為GA1的初始征象[6]。較大嬰兒或兒童可能出現嗜睡、嘔吐、生長遲滯、癲癇發作或與間發疾病相關的急性失代償，常伴有感染和發熱。本研究中確診GA1患兒就診時的臨床表現以腹瀉、抽搐為主，與既往文獻報道一致[7]，但不同的是此患兒無頭顱的畸形。本例患兒的核磁共振結果是雙側放射冠及額顳葉皮層下斑片狀異常信號，不符合陳娟等人報道的影像學[8]。這與以往報道的有所不同，很容易被誤診為感染性或免疫性腦病。醫生應仔細詢問病史，GA1的神經系統受累征象是呈進行性加重的，有別于感染性腦病或免疫性腦病。

本研究在其他原因引起的代謝異常中，氨基酸代謝異常最多見，共有23例患兒；其中氨基酸降低主要以甲硫氨酸、瓜氨酸降低為主，氨基酸增高主要表現為苯丙氨酸與酪氨酸的比值異常。通過串聯質譜、臨床表現及基因分析，23例患兒未診斷為IMD，出現假陽性結果，分析存在以下因素。① 氨基酸指標對溫度、濕度變化敏感：Golbahar等[9]研究發現，血片在高溫高濕貯藏8 d，大多數氨基酸損失了近50%的初始濃度；本研究中175例患兒大部分來自海南本地區，海南省高溫高濕氣候可能影響干血斑樣本中特殊物質濃度的變化，特別是甲硫氨酸的降低，從而造成結果的不穩定性和不準確性。② 民族差異：海南地區存在很多的少數民族，不同民族的串聯質譜篩查中氨基酸指標濃度值存在差異。③ 樣本處理：氨基酸異常最多的原因還與樣本量少、放置時間長有關[10]。④機體狀態：有研究顯示，機體狀態如急性感染、手術、創傷、生產、禁食等事件下可造成暫時性代謝紊亂，或因機體在空腹或餐后時間過短影響體內氨基酸水平[11]。⑤檢測技術水平差異：不同檢測團隊篩查水平參差不齊，陽性切割值、參考范圍不同，實驗室間缺乏統一質控，同一質控樣本在不同篩查實驗室可能會得到不同的臨床診斷，這些均對陽性率也產生一定影響。因此對假陽性的患兒，臨床醫生需要區分患兒異常是繼發還是遺傳，需進行進一步追蹤觀察，必要時進行基因檢測。本研究中22例代謝異常的患兒因家庭經濟困難、監護人文化水平不高等原因造成診療依從性差，未能及時召回復查，也有少數疑似病例在隨訪中丟失或拒絕隨訪。因此建立標準的IMD篩查技術、流程或指南以及成熟完整的陽性召回隨訪制度，對血尿篩查陽性的患兒進行統一管理十分必要。早期診斷、長期隨訪和治療，可有效降低兒童的傷殘率及病死率[12,13]。

IMD診斷依賴于較高的懷疑指數，特別是存在某些關鍵性表現(如低血糖或高氨血癥)的患兒應考慮IMD，串聯質譜篩查技術可提高IMD的診斷準確性。與此同時，我們也發現串聯質譜篩查指標受到機體自身的狀態及外界環境因素的影響容易出現假陽性及假陰性的結果。因此，醫生應結合患兒的臨床表現和輔助檢查綜合分析，必要時多次檢測驗證或者經基因檢測明確診斷，以免發生漏診或誤診的情況。