miR-199a-3p在卵巢癌組織中的表達及其對癌細胞增殖轉移的影響

宋洋，任芳

中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽117004

卵巢癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤，致死率居婦科腫瘤之首[1]。該病早期無明顯癥狀，多數患者在確診時已是癌癥晚期[2]。miRNA是一類平均長度約22個堿基的單鏈非編碼小RNA分子，在真核細胞中廣泛存在。miRNA通過部分或完全結合靶基因信使RNA的3′非編碼區堿基進而發揮負向調控基因表達的作用[3]。大量研究表明，miRNA不僅參與細胞的增殖、分化、凋亡、代謝等正常生理過程，還與腫瘤的發生發展密切相關[4,5]。研究發現，在卵巢癌組織中miR-199a-3p表達降低，可能具有抑癌作用，然而其作用機制仍不清楚[6]。2018年11月～2019年7月，本研究對miR-199a-3p在卵巢癌細胞中的表達及對癌細胞增殖轉移影響的可能機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞株SK-OV-3、OV-90、CAOV3、HO-8910S購自上海中喬新舟生物科技有限公司，OVCAR3細胞購自北京北納生物科技有限公司；其中SK-OV-3細胞和HO-8910細胞培養于PRMI-1640培養液中(含15%胎牛血清)，OV-90細胞和CAOV3細胞培養于42.5%MCDB105(含1.5 g/L碳酸氫鈉)+42.5%M199(含2.2 g/L碳酸氫鈉)培養基中(含15%胎牛血清)；培養基以及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。CCK-8檢測試劑購自日本同仁公司；NC mimic和miR-199a-3p mimic由上海吉瑪基因合成；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉錄酶購自百泰克生物技術有限公司；SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司；pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 細胞miR-199a-3p表達檢測 采用TRLzol試劑提取組織和細胞的總RNA，并通過TIANSeq M-MLV反轉錄成cDNA，試驗步驟參照試劑說明進行操作。采用SYBR Green qPCR Mix進行熒光定量反應，熒光定量總反應體系為20 μL，其中含有cDNA模板2 μL，SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加雙蒸水至20 μL。試驗中所用引物序列如下：smad1，上游引物：5′- AACCGTTTGAAGTGTAA-3′，下游引物：5′-5′-AAACAAACTGGGAAAGA-3′；β-actin，上游引物：5′-CGCCCCAGGCACCAGGGC-3′，下游引物：5′-GCTGGGGTGTTGAAGGT-3′。采用2-△△Ct法計算細胞株miR-199a-3p相對表達量。

1.3 細胞轉染 取適量細胞接種于6孔板中，待細胞長至70%融合時進行轉染。同株細胞分為三組：對照組、NC mimic轉染組、miR-199a-3p mimic組。對照組不加任何試劑，miR-199a-3p mimic組、NC mimic轉染組分別加入miR-199a-3p mimic和NC mimic轉染試劑，試驗步驟按試劑說明進行操作。轉染后的細胞繼續培養6 h后，更換為完全培養基繼續培養。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。按照每孔3×103個的密度將細胞接種至96孔板。于細胞轉染后24、48、72、96 h時向每孔加入MTT試劑(20 μL，5 mg/mL)，繼續培養4 h后棄去培養液，加入DMSO溶液150 μL， 10 min后在酶標儀上測量570 nm處的吸光度值。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室試驗檢測卵巢癌細胞的遷移能力。轉染48 h后，取對數期生長的細胞，用無血清培養基重懸后，取適量細胞加入上室，下室加入700 μL 完全培養基，繼續培養24～48 h后取出。上室的細胞用棉簽處理干凈，轉移到下室的細胞用4%多聚甲醛固定，0.25%結晶紫染色，最后于顯微鏡下拍照記錄計數細胞。

1.6 卵巢癌細胞中miR-199a-3p對smad1調控作用檢測 將含有smad1能夠被miR-199a-3p識別的野生型序列(5′-ACCTCTGTGACCAAC TATTG-3′)的質粒wt-smad1和含有smad1突變型序列(5′- ACCTCTGTGACCATAATTTG -3′)的質粒mut-smad1分別與miR-199a-3p mimic或NC mimic共轉染至細胞內。轉染24 h后采用雙熒光素酶報告系統檢測各組的熒光強度。

2 結果

2.1 miR-199a-3p 在卵巢癌細胞中的表達 人卵巢癌細胞株SK-OV-3、CAOV3、HO-8910S、OV-90的miR-199a-3p的相對表達量分別為1.00±0.00、0.80±0.11、3.00±0.31、0.32±0.04。顯示miR-199a-3p在CaOV3和OV-90卵巢癌細胞中表達水平低于其他細胞(P均<0.05)。因此選擇這兩株細胞用于后續過表達miR-199a-3p的研究。

2.2 轉染細胞miR-199a-3p表達 miR-199a-3p mimic轉染至CaOV3和OV-90卵巢癌細胞后，CaOV3卵巢癌細胞對照組、NC mimic轉染組、miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達分別為1.00±0.00、1.03±0.16、3.17±0.35。OV-90卵巢癌細胞對照組、NC mimic轉染組、miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達分別為1.00±0.00、1.06±0.13、3.25±0.38。顯示miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達較對照組、NC mimic轉染組升高(P均<0.05)。

2.3 miR-199a-3p過表達對卵巢癌細胞增殖能力的影響 MTT檢測結果顯示，CAOV3細胞、OV-90細胞miR-199a-3p mimic組較對照組、NC mimic轉染組在相同時間點增殖能力降低(P均<0.05)，見表1、表2。

表1 過表達miR-199a-3p對CAOV3細胞增殖能力的影響

注：與對照組、NC mimic轉染組比較，*P<0.05。

表2 過表達miR-199a-3p對OV-90細胞增殖能力的影響

注：與對照組、NC mimic轉染組比較，*P<0.05。

2.4 過表達miR-199a-3p對卵巢癌細胞轉移能力的影響 Transwell試驗結果顯示，CaOV3卵巢癌對照組、NC mimic轉染組、miR-199a-3p mimic組細胞遷移數量分別為(63.4±6.91)、(64.2±5.54)、(28.7±3.21)個。OV-90卵巢癌細胞對照組、NC mimic轉染組、miR-199a-3p mimic組細胞遷移數量分別為(66.2±6.02)、(66.5±4.65)、(31.9±3.63)個。兩株細胞中，miR-199a-3p mimic組細胞轉移能力均低于對照組(P均<0.05)。

2.5 卵巢癌細胞中miR-199a-3p對smad1的調控作用 雙熒光素酶報告試驗結果顯示，共轉染wt-smad1 3′UTR質粒和NC mimc 的細胞熒光素酶強度為0.722±0.094，共轉染 wt-smad1 3′UTR質粒和miR-199a-3p mimic的細胞熒光素酶強度為0.285±0.042，共轉染mut-smad1 3′UTR質粒和NC mimic的細胞熒光素酶強度為0.684±0.083，共轉染mut-smad1 3′UTR質粒和miR-199a-3p mimic的細胞熒光素酶強度為0.679±0.087。與其他細胞比較，wt-smad1 3′UTR+ miR-199a-3p mimic細胞中相對熒光素酶活性降低(P均<0.05)；wt-smad1 3′UTR+NC mimic的細胞和mut-smad1 3′UTR+miR-199a-3p mimic的細胞中熒光素酶的活性均未發生變化。提示miR-199a-3p能夠靶向結合smad1的3′UTR區進而調控其表達。

3 討論

大量研究證實，miRNA在多種癌癥的發生發展中起重要作用，miRNA的異常表達常具有作為腫瘤標記物及治療靶點的潛力[7,8]。研究證實，在卵巢癌中有包含miR-199a在內的25種miRNAs下調，提示miR-199a-3p的異常表達可能與卵巢癌不良預后相關[9]。

miRNA的功能主要是通過調控下游靶基因實現的，同一個miRNA能夠靶向調控多個目的基因從而發揮類似致癌基因或抑癌基因的作用[10,11]。大量研究表明，miR-199a-3p在多數腫瘤中發揮抑癌作用，在骨肉瘤細胞中上調miR-199a-3p的表達能夠抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉移能力，臨床上低表達miR-199a-3p與骨肉瘤的不良預后密切相關[12]。Ren等[13]在肝癌細胞中過表達miR-199a-3p能夠顯著抑制細胞增殖并促進肝癌細胞的凋亡，其作用機制與調控YAP1基因有關。類似地，miR-199a-3p在腎癌組織中表達下降，過表達miR-199a-3p對腎癌細胞系的增殖、侵襲和轉移均有負向調控作用[14]。Phatak 等[15]報道miR-199a-3p在食道癌組織和食道癌細胞中表達下降，過表達miR-199a-3p抑制食道癌細胞的增殖，其作用可能通過靶向調控PAK4基因實現的。本研究進一步證實將miR-199a-3p mimic轉染至卵巢癌細胞后，顯示過表達 miR-199a-3p的卵巢癌細胞其增殖和轉移能力都明顯降低，此結果與既往研究結論一致[16,17]，即miR-199a-3p能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和轉移，發揮類似抑癌基因的作用。

由于miRNA的功能主要是通過調控下游靶基因實現的，我們進一步探討在卵巢癌細胞中miR-199a-3p可能調控的下游靶基因。經生物學軟件分析，miR-199a-3p的種子序列與smad1的3′UTR區互補結合。 經雙熒光素酶試驗進一步顯示，轉染了野生型smad1 3′UTR載體和miR-199a-3p mimic的細胞組雙熒光素酶活性明顯低于轉染了突變型smad1 3′UTR的細胞組，表明smad1是miR-199a-3p的直接作用靶點。Smad1是一種重要的信號轉導分子， 對機體免疫系統、組織胚胎發育、細胞生長分化等正常生理進程以及對腫瘤發生發展有重要作用；如smad1能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，且與腫瘤上皮細胞間質化有關[18～20]。本研究結果提示，miR-199a-3p可能通過作用smad1基因表達來發揮抑制卵巢癌細胞增殖和轉移的作用。

綜上， miR-199a-3p的表達與卵巢癌的發生發展密切相關。miR-199a-3p在卵巢癌組織中表達下降，miR-199a-3p過表達能夠抑制卵巢癌細胞的增殖與轉移，且可能通過調控smad1的表達而實現。