HPLC-CAD法同時測定乳制品中糖類

游正琴，楊勇，許乾麗，楊園園

（1.貴陽醫學院，貴陽550004；2.貴陽中醫學院，貴陽550002；3.貴州省食品藥品檢驗所，貴陽550004）

0 引言

常見的乳制品有奶昔、奶粉和發酵乳，主要含糖類、蛋白質和脂肪等成分。糖類化合物是人體生命活動過程中的重要物質，如過多的果糖攝入可以引起脂質代謝異常、胰島素抵抗和高尿酸血癥等一系列代謝綜合征的表現[1]。因此，對常見乳制品中糖類化合物的分析具有重要意義。

目前，乳制品中糖類化合物檢測方法有多種，如高效液相色譜法、氣相色譜法及紙層析法等[2]。高效液相色譜法快速、準確，得到廣泛應用[3]。常采用的檢測器有示差折光率檢測器（RID）[4]和蒸發光散射檢測器（ELSD）[5]。但RID靈敏度較低，易受溫度和流動相的影響，在進行多組分分析時效果不好。電子噴霧檢測器(CAD)是新型的通用型質量檢測器，其不依賴于分析物的結構也不需要將分析物電離，只要待分析物屬于半揮發性或非揮發性化合物就可以被檢測出[6]，該檢測器較RID和ELSD靈敏度高、操作簡單、易于控制，在國內外研究中得到應用[7-8]。但是，采用HPLC-CAD法測定乳制品中糖類化合物的文章還未見有報道。

1 實驗

1.1 儀器與設備

高效液相色譜儀(美國戴安公司，配四元梯度泵，120位自動進樣器，Chromeleon色譜工作站，電子噴霧檢測器)；Shodex Asahipak NH2P—50 4E色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)日本昭和電工株式會社；XS 205電子天平瑞士梅特勒公司；KQ—500AD型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋南昌市恒順化驗設備制備有限公司；0.45 μm的微孔濾膜。

1.2 材料與試劑

奶昔、學生配方奶粉、嬰兒奶粉、低乳糖風味發酵乳、零脂果粒發酵乳，均為市售。

果糖對照品(純度為99.5%C139475 lot:00628），半乳糖對照品（純度為99.5%C13996500 lot:10509），葡萄糖對照品(純度為99.5%C14027000 lot:90126)，蔗糖對照品(純度為99.5%C16901100 lot:81111)，乳糖對照品（純度為99.5%C1459080 lot:00527），麥芽糖對照品(純度為99.0%C1473470 lot:20613)。

乙腈(色譜純)，硫酸鋅(分析純)，亞鐵氰化鉀(分析純)，實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P—50 4E(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流動相：乙腈-水(80:20)；流速為1.0 mL/min；檢測器：Corona電子噴霧檢測器(氣壓 35.0 Pa)。

1.3.2 對照品溶液的配制

精密稱取果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖對照品適量(精確到0.00 001 g)，分別置于25 mL的容量瓶中，加入去離子水5 mL，超聲5 min，再加入乙腈定容，搖勻。制得質量濃度分別為5.0 550，5.0327，4.9209，5.0757，5.0163，4.9543 g/L的對照品儲備溶液，冷藏，備用。

1.3.3 樣品處理

精密稱取上述各種乳制品樣品適量(0.5～2.0 g)于50 mL的離心管中，精密加入超純水40.0 mL，超聲5 min，又精密加入30%硫酸鋅溶液5.0 mL，置100℃水浴5 min，搖勻，再精密加入10%亞鐵氰化鉀溶液5.0 mL，搖勻，使其充分沉淀，冷卻至室溫，離心（5 000 r/min）5 min。精密量取上清液2.0 mL于10 mL容量瓶中，加入乙腈定容，搖勻，過濾（0.45 μm），作為供試品溶液，供HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

實驗嘗試了流動相乙腈和水的不同比例，如乙腈-水(75∶25)、乙腈-水(80∶20)、乙腈-水(85∶15)。最后，根據6種糖的分離效果，最終確定流動相配比為乙腈-水(80∶20)，如圖1所示，6種糖完全分離。

圖1 混合標準品色譜

2.2 樣品處理的優化

實驗嘗試了3種沉淀蛋白質的方法：(1)加水15 mL溶解后，用乙腈定容至刻度，即現行國家標準方法[9]；(2)加水10 mL溶解后，加入質量分數為1%的三氯乙酸定容；(3)加水40 mL溶解后，分別加入質量分數為30%硫酸鋅的和10%亞鐵氰化鉀各5 mL。以提取液的澄清度和加標回收率為考察指標，結果：第三種方法得到的樣品提取液澄清且回收率良好；第一種方法的得到的奶昔提取液不夠澄清，過濾困難，方法回收率低；第二種方法的乳化現象嚴重，過濾困難，加標回收率不佳，與文獻報道一致[10]。第三種方法采用無機試劑，毒性小，環保，結果如圖2所示，能有效消除雜質對樣品分析的影響。故采用第三種方法沉淀蛋白等雜質。

圖2 樣品色譜

2.3 線性范圍和檢出限

精密吸取1.4中的對照品儲備溶液，配制5組混合標準品溶液，使果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖的質量濃度依次分別為 0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 g/L；0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/L；0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L；0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 g/L；0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L；0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 g/L。按1.3.1中的色譜條件進行測定，以對照品的峰面積(Y)對其質量濃度(X/(g·L-1))繪制工作曲線，得到回歸方程、相關系數。逐級稀釋對照品儲備液，以基線3倍噪聲值的對照品濃度計算方法檢出限，結果如表1所示。本研究的檢出限與采用HPLC-ELSD檢測的同種糖類化合物的檢出限[11-12]作比較可知：采用HPLC-CAD測定糖類化合物時檢出限比采用HPLC-ELSD測定的檢出限低1～2個數量級。

表1 HPLC-CAD方法測定乳制品中各種糖的線性范圍及檢出限

2.4 回收率和精密度

稱取樣品0.25 g（n=6)，分別依次精密加入適量標準品，按照1.3.3中制成供試品溶液和1.3.1中的色譜條件，對樣品溶液進行含量測定，并計算回收率和相對標準偏差。結果如表2所示，其6種糖的平均回收率在93.6%～104.3%之間，相對標準偏差在2.05%～5.59%之間。

表2 HPLC-CAD方法的添加回收率實驗

2.5 穩定性

稱取樣品0.5 g，按1.3.3中的方法制成供試品溶液并按1.3.1中的色譜條件，于0，4，6，8，12，16，24 h分別進樣測定各組分的峰面積,并計算其RSD值。結果：同一供試品溶液中果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖在24 h內峰面積的RSD%分別為2.45%，3.68%，2.91%，3.24%，3.90%，3.48%，均不大于5%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

糖類化合物為碳水化合物，易被微生物分解破壞。在本實驗過程中，采用重鉻酸鉀洗液清洗樣品前處理過程中的玻璃儀器和用75%乙醇清洗塑料離心管，除去細菌。避免細菌對樣品中待測成分的分解，增加供試品溶液穩定性，確保測定結果的準確，可靠。

2.6 樣品質量分數測定

將上述樣品按照1.3.3項制成供試品溶液并按1.3.1項下色譜條件進行測定，結果如表3所示。通過對市售乳制品的分析可知，本研究建立的HPLC—CAD法快速、準確，能夠滿足實際分析工作的需要。

3 結論

本研究建立了HPLC—CAD法同時測定乳制品中果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖的檢測方法。方法檢出限較低，回收率、精密度和穩定性均能滿足實際分析的需要。樣品的前處理過程中不使用有機溶劑，降低檢驗工作者的健康風險，對環境更加友好。電噴霧檢測器的使用簡單，易于推廣和應用。本文所建立的方法也可用于含蛋白質食品中糖類化合物的分析測定。

表3 HPLC-CAD方法測定各種乳制品的含糖量 %

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