飼料中不同水平重金屬鉻對(duì)牛乳中鉻的影響

田成新，李然，李琳瑤，滿朝新，李婷，劉少敏，婁彬彬，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

隨著人口的快速增長(zhǎng)、城市化及工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，且大多數(shù)工業(yè)廢物含有大量的重金屬污染物[1,2]，其中重金屬鉻可以污染土壤和水源，進(jìn)而在植物中蓄積，最終經(jīng)食物鏈危害人體健康[3]。有研究表明，鉻（特別是六價(jià)鉻）可以對(duì)人體的呼吸道、胃腸道、皮膚等造成損傷[4]。乳及乳制品是人類膳食中的重要組成部分，有毒重金屬污染的牛奶可能嚴(yán)重危害人類的健康[5]。鉻是乳中重要監(jiān)控的污染物之一，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，生鮮乳中鉻的限量值為0.3 mg/kg[6]。因此，研究奶牛外源攝入鉻對(duì)泌乳中鉻的含量影響，對(duì)保證原料乳的安全有重要意義。本研究以煙酸鉻形式飼喂奶牛不同劑量的鉻，檢測(cè)原料乳中重金屬鉻含量，研究飼料中不同水平的鉻對(duì)奶牛泌乳中鉻含量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)選取15頭體況、泌乳期段及產(chǎn)奶量基本相同的荷斯坦奶牛。所選奶牛日產(chǎn)奶量約30 kg，年齡約為2～5歲，體質(zhì)量約為600 kg，飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)相同，健康狀況良好。

主要試劑：煙酸鉻（飼料級(jí)≥99.5%）；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液（鉻Cr質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，介質(zhì)10%HNO3）；硝酸（高純?cè)噭㎝OS）；高氯酸（高純?cè)噭㎝OS）；純牛奶（全脂乳）。

主要儀器：原子吸收光譜儀（PinAAcle 900H），電熱消解儀（EHD 36），超純水制造系統(tǒng)（MILLI-Q），數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），電子天平（0.001g），50 mL帶刻度玻璃消解管（GC-36-L）。

1.4 方法

1.4.1 奶牛的飼喂與管理

本研究選取了某牧場(chǎng)的15頭奶牛，試驗(yàn)所處季節(jié)為秋季（9～11月份）。從所選的15頭牛隨機(jī)平均分為3組，分別定義為低劑量組、中劑量組和高劑量組。15頭試驗(yàn)牛與大群分欄隔離喂養(yǎng)，統(tǒng)一榨乳。奶牛通過自鎖式頸夾進(jìn)行自由采食，通過不銹鋼保溫自動(dòng)飲水槽自由飲水。采用由牧場(chǎng)奶牛營(yíng)養(yǎng)部門提供的泌乳期高產(chǎn)牛日糧進(jìn)行飼喂。

1.4.2 給藥

本試驗(yàn)的奶牛給藥方式采用經(jīng)口給藥方式，以煙酸鉻的形式給奶牛灌喂不同劑量水平的鉻，劑量設(shè)計(jì)如表1所示。給藥時(shí)間為每天16:00～17:00之間，煙酸鉻連續(xù)給藥40 d后停藥。

表1 劑量組設(shè)計(jì) g/d

重金屬鉻的中劑量選擇，綜合了奶牛日攝入青貯、精料、飼料、豆粕、水等投入品可能接觸鉻的風(fēng)險(xiǎn)劑量，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)方法設(shè)計(jì)低、高劑量值[7]。三個(gè)劑量的劑量倍數(shù)為3.16倍，且劑量均在奶牛的安全范圍內(nèi)。

1.4.3 樣品的采集

實(shí)驗(yàn)牛采用韋斯伐里亞轉(zhuǎn)盤式機(jī)械擠奶系統(tǒng)進(jìn)行榨乳，在榨乳前后都對(duì)設(shè)備進(jìn)行充分自動(dòng)清洗。本研究每天上午進(jìn)行奶樣的采集。第一次灌喂藥物前采集的奶樣為第0天的樣品，此后以此類推喂藥后第1，2，3，……天。采樣瓶采集的奶樣分裝到50 mL酸清洗過的聚乙烯塑料離心管中（一式三份），將采集的樣品進(jìn)行編號(hào)，立即放入-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.4 樣品中鉻的測(cè)定

（1）樣品前處理。稱取約5 g奶樣（精確到0.001 g）于50 mL玻璃消解管中，加入10 mL 9∶1混酸（硝酸∶高氯酸），加蓋浸泡過夜進(jìn)行預(yù)消解，過夜消解后再將消解管放到電熱消解儀上先在100℃下加熱消解，待消解液呈黃色透明狀態(tài)時(shí)，將溫度逐步提升（120～150℃），最后升高到180℃以上加熱消解趕酸，若樣品變?yōu)楹谏瑒t滴加數(shù)滴濃硝酸繼續(xù)消解直至黑色消失，待加熱到樣品近干后，取下消解管冷卻后用2%硝酸定容到50 mL，充分搖勻待上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)做3個(gè)平行試劑空白。

（2）儀器條件。參考GB/T 5009.123-2003《食品中鉻的測(cè)定》[8]，并結(jié)合儀器推薦的條件進(jìn)行優(yōu)化。石墨爐原子吸收光譜儀工作參數(shù)：波長(zhǎng)357.87 nm鉻空心陰極燈，燈電流為8 mA，狹縫寬度為0.7 nm；進(jìn)樣量為20 μL；背景校正為氘燈；基體改進(jìn)劑5 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%磷酸二氫銨溶液，升溫程序如表2所示。

表2 鉻檢測(cè)的石墨爐升溫程序

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

把50 μg/L鉻標(biāo)準(zhǔn)工作液倒入樣品杯中，放在系統(tǒng)所編輯的樣品盤的杯位，儀器根據(jù)編輯好的濃度梯度進(jìn)行梯度稀釋并自動(dòng)引入樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋液為超純水。鉻的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0，10，20，30，40，50 μg/L。儀器測(cè)量由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度，進(jìn)樣量為20 μL。鉻的校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)類型為L(zhǎng)inear Through Zero，采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)量，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為自變量，元素吸光度為因變量，利用儀器AA WinLab軟件處理做線性回歸，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相關(guān)系數(shù)，以用于樣品濃度的測(cè)量。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不同處理組、不同時(shí)間內(nèi)的平均值比較用LSD和Duscan氏進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～50 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999，線性良好，可以用于樣品中鉻的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。本方法用于原料乳中鉻的含量的檢測(cè)檢出限可達(dá)0.005 mg/kg。

圖1 鉻檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 回收率與精密度

分別向5 g牛奶加入0.25 mL質(zhì)量濃度為1 μg/L的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5 mL的1 μg/L的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/L的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平分別為0.05，0.10，0.20 mg/kg的3組樣品，每組做5個(gè)平行，同時(shí)做空白樣品組。進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，鉻檢測(cè)平均回收在93.53～95.55%范圍內(nèi)，滿足檢測(cè)要求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.59～3.67%的合理范圍內(nèi)。

表3 鉻的加標(biāo)回收率和精密度

2.3 飼喂煙酸鉻對(duì)牛乳中鉻含量的影響

根據(jù)所建立的樣品前處理方法和石墨爐原子吸收光譜法的儀器條件，分別對(duì)低、中、高劑量組的奶牛的奶樣中鉻濃度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)每組中奶牛樣品鉻濃度取平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，利用EXCEL軟件以時(shí)間點(diǎn)天數(shù)(d)為橫坐標(biāo)，牛乳中鉻的質(zhì)量濃度(mean±SD)為縱坐標(biāo)，繪制乳中鉻濃度隨時(shí)間變化規(guī)律的曲線，分別見圖2～4。

圖3 中劑量組牛乳中鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)—時(shí)間曲線

圖4 高劑量組牛乳中鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)—時(shí)間曲線

由圖2～圖4可以看出，給奶牛飼喂低、中、高劑量鉻后，牛乳中鉻的含量無(wú)明顯的升降趨勢(shì)，鉻含量維持在一個(gè)相對(duì)恒定的濃度范圍內(nèi)，且個(gè)頭牛之間的個(gè)體差異較大。為進(jìn)一步研究不同劑量組對(duì)奶牛泌乳中鉻的含量影響，將三個(gè)劑量組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分為7組，分別為飼喂前對(duì)照組（0 d）、飼喂1～10 d組、飼喂11～20 d組、飼喂21～30 d組、飼喂31～40 d組、停藥后1～17 d組、停藥后18 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束組。利用SPSS軟件對(duì)6組數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量方差分析，分析結(jié)果如表4所示。

表4 飼喂不同劑量的煙酸鉻對(duì)不同時(shí)期牛乳中鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 mg/kg

由表4可以看出，連續(xù)飼喂奶牛0.47 g劑量的鉻40 d，與鉻飼喂前的對(duì)照組相比，奶牛在喂藥及停藥期間乳中鉻的含量無(wú)顯著變化(P＞0.05)，停藥后1～17 d期間較飼喂1～10d期間，牛乳中鉻的含量升高，差異顯著(P＜0.05)；連續(xù)飼喂奶牛1.5 g劑量的鉻40 d，飼喂21～30 d期間，牛乳中鉻較鉻飼喂前的對(duì)照組含量升高，差異顯著(P＜0.05)，其余時(shí)間內(nèi)牛乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性變化(P＞0.05)；連續(xù)飼喂奶牛4.74 g劑量的鉻40 d，飼喂21～40天期間，牛乳中鉻較鉻飼喂前的對(duì)照組質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，差異顯著(P＜0.05)，其余時(shí)間內(nèi)牛乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。各劑量飼喂組牛乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生鮮乳中鉻的限量值0.3 mg/kg[6]。本研究中，中劑量組和高劑量組中分別有一頭奶牛因乳房炎和右后腿受傷而接受治療，統(tǒng)計(jì)分析中把接受治療的奶牛去除，這不會(huì)影響對(duì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確解釋[8]。

K.E.Lloyd[9]等人為評(píng)價(jià)鉻添加對(duì)牛乳及肉中鉻的殘留量的安全性，對(duì)奶牛產(chǎn)前30 d及產(chǎn)后90 d進(jìn)行了為期120 d的鉻添加飼喂，添加方式為向奶牛日糧中添加丙酸鉻，相當(dāng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/kg的鉻。研究結(jié)果表明，鉻的添加對(duì)奶牛乳、肌肉及脂肪等人類消費(fèi)產(chǎn)品中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著影響。梁茂文[10]等人向奶牛日糧中添加4，8，12 mg/（頭·d）的吡啶羧酸鉻，對(duì)牛乳中鉻的沉積影響不大(P＞0.05)。詹凱[11]等人向泌乳牛日糧中添加2 mg有機(jī)鉻，這對(duì)鉻在乳中的沉積有一定的作用，但添加量超過一定劑量時(shí)，對(duì)鉻在乳中沉積起阻礙作用。本實(shí)驗(yàn)中奶牛經(jīng)過不同劑量水平的鉻飼喂后，考慮到奶牛個(gè)體代謝差異的影響，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，盡管有少數(shù)時(shí)間段內(nèi)奶牛泌乳中鉻的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有增加(P＜0.05)，但是其余大多數(shù)時(shí)間段內(nèi)牛乳中鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性變化(P＞0.05)，表明口試飼喂的鉻不易通過牛體向牛乳中遷移沉積。

3 結(jié)論

本研究建立的濕式消解-石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)原料乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，此方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，精密度高，檢測(cè)限可達(dá)0.005 mg/kg，適用于原料乳中重金屬鉻的檢測(cè)。

本研究15頭泌乳期奶牛以煙酸鉻形式分別飼喂0.47，1.50，4.74 g/d的鉻，連續(xù)飼喂40 d。不同劑量鉻的飼喂對(duì)奶牛泌乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著影響，牛乳中鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)明顯的升降趨勢(shì)，鉻的量維持在一個(gè)相對(duì)恒定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，且鉻在牛乳中呈現(xiàn)非劑量相關(guān)型殘留，表明飼料中鉻不易向牛乳中遷移。乳中總鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3 mg/kg，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2762-2012《食品中污染物限量》對(duì)生鮮乳中總鉻的限量值(0.3 mg/kg)。

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