黑龍江省生乳中β-內酰胺酶的監測與結果分析

楊光，邢宇，趙平，陳麗，丁松喬

（黑龍江省質量監督檢測研究院，哈爾濱150028）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，乳制品的安全問題備受關注。由于利益驅動，一些不法商家，向生乳中添加“抗生素分解劑”來掩蓋抗生素的存在。經證實，這種分解劑為“β-內酰胺酶”[1]。

β-內酰胺酶是細菌對抗生素產生耐藥性的主要原因，因此，過多攝入會對人體產生不良后果[2]。衛生部于2009年3月相繼發布了關于印發《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》的通知（衛監督發[2009]21號）和關于印發《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知（食品整治辦[2009]29號），明確指出“添加β-內酰胺酶（等）非食品用物質屬違法行為”[3,4]。

1 實驗

1.1 樣品來源

本研究共采集了400份生乳樣品。樣品采集地點分別為黑龍江省內的奶站、運輸車、生產企業收奶間及奶倉等。根據生乳不易保存的特點，為確保監測準確性，必須在最短的時間內完成樣品的檢測工作；樣品采集后立即放入0～4℃冷藏箱中保存，并于當天送至實驗室進行檢測。

1.2 方法

檢測采用食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法-杯碟法》進行[5]。

1.2.1 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

抑菌圈測量儀；恒溫培養箱（36℃±1℃）；高壓蒸汽滅菌器；無菌培養皿（內徑90 mm，底部平整光滑的玻璃皿）；無菌牛津杯（外徑8.0 mm±0.1 mm，內徑6.0 mm±0.1 mm，高度10.0 mm±0.1mm）。

標準比濁管；恒溫水浴；無菌吸管：1 mL（0.01 mL刻度值），10 mL（0.1mL刻度值）；加樣器（5～20 μL，20～200 μL及配套吸頭）；全自動牛津杯放置器；陶瓦蓋。

1.2.2 培養基和試劑

所用試劑均為分析純，水為GB/T6682中規定的三級水。

實驗菌種：藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，傳代次數不得超過14次。

磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）；生理鹽水（8.5 g/L）；青霉素鉀鹽（D.R）標準溶液；β-內酰胺酶（Sigema）標準溶液；舒巴坦（D.R）標準溶液；營養瓊脂培養基；抗生素檢測用培養基Ⅱ。

1.3 操作步驟

1.3.1 菌懸液的制備

將藤黃微球菌接種于營養瓊脂斜面上，經（36±1）℃培養18～24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測定菌懸液濃度，終濃度為1×1010mL-1，4℃保存，貯存期限2周。

1.3.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標為：A、B、C、D，每個樣品做三個平行，共12管，同時每次檢驗應取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。

1.3.3 檢驗用平板的制備

取90 mm滅菌玻璃培養皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養基Ⅱ，凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108mL-1藤黃微球菌的抗生素檢測用培養基Ⅱ，凝固后備用。

1.3.4 樣品的測定

按照下列順序分別將青霉素標準溶液、β-內酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到樣品及純水中：

A ：青霉素5 μL。

B ：舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

C ：β-內酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。

D ：β-內酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

混勻后，將上述A～D試樣各200 μL加入放置于檢驗用平板上的4個無菌牛津杯中，（36±1）℃培養培養18～22 h，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗平均值。

1.3.5 結果報告

純水樣品結果應為：（A）、（B）、（D）均應產生抑菌圈；（A）的抑菌圈與（B）的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(含3 mm)，且重復性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復性良好。如為此結果，則系統成立，可對樣品結果進行如下判定。

（1）如果樣品結果中（B）和、（D）均產生抑菌圈，且（C）與（D）抑菌圈差異在3 mm以上（含3 mm）時，可按下述（2）（3）判定結果。

（2）（A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復性良好，應判定該試樣添加有β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶類藥物檢驗結果陽性。

（3）（A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差異小于3 mm，且重復性良好，應判定該試樣未添加有β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶類藥物檢驗結果陰性。

（4）如果（A）和（B）均不產生抑菌圈，應將樣品稀釋后再進行檢測。

2 結果與討論

（1）本研究共監測生乳樣品400批次，其中392批次檢驗結果為β-內酰胺酶陰性，8批次檢驗結果為β-內酰胺酶陽性，分布在5家企業。樣品陽性率2%。8批次陽性樣品分別在三次實驗中出現，詳細數據見表1。

（2）本研究采集的400批次樣品，β-內酰胺酶陽性僅為8批次，陽性率為2%（見圖1）。其原因主要是各級有關政府部門近年來加大了對使用非法添加物等行為的打擊力度，并且企業也增加了對β-內酰胺酶的檢測頻次。即便如此，仍有8批次的生乳樣品β-內酰胺酶檢測結果呈陽性。這說明個別奶農仍因利益驅動，向含有抗生素的生乳中而非法加入β-內酰胺酶，以降解抗生素。

表1 β-內酰胺酶陽性樣品實驗數據 mm

圖1 生乳中β-內酰胺酶監測結果

本次乳及乳制品中β-內酰胺酶的樣品采集涵蓋了生產與流通兩大領域。根據不同產品的特點，采樣地點分別在奶站、運輸車、生產企業收奶間及奶倉，表2體現了不同采樣環節的樣品情況。

表2 不同采樣環節乳及乳制品β-內酰胺酶檢測結果統計結果

監測結果表明：在奶站采集的207批次產品，3批次呈陽性，陽性率1.4%；運輸車抽檢180批次，5批次呈陽性，陽性率2.8%。說明最易出現問題的兩個環節為奶站與運輸車，不排除在這兩個環節非法添加β-內酰胺酶的可能性。

2.3 原因分析

近十幾年來，我國奶牛養殖業快速發展，養殖模式向著集約化、現代化大型牧場發展。特別是2014年起國家要求嬰幼兒配方乳粉生產企業須建自有牧場更加速了這一進程。但根據我國國情，目前仍以分散養殖為主。由于分散養殖飼養條件差、技術落后等因素致使奶牛乳房炎等疾病發病率仍居高不下，導致奶農盲目大量使用抗生素。特別是β-內酰胺類抗生素由于價格低、效果好、容易獲得等原因而普遍使用。這對于泌乳期的奶牛而言，所生產的牛奶中就會含有一定量的抗生素殘留。個別奶農為減小損失仍將含有抗生素殘留的牛奶送交企業，就需在奶中加入β-內酰胺酶以降解抗生素。自2009年3月原衛生部將其列為非法添加物以來，隨著相關部門監管力度加大與企業在收購時的檢測，非法添加β-內酰胺酶現象逐年下降，由原來的普遍添加到目前極個別奶農的非法添加。即便如此，仍時有發生，不能從根本上加以拒絕。根據對不同環節β-內酰胺酶檢測結果看，不合格樣品全部來自于奶站與運輸車，所以在這兩個環節添加β-內酰胺酶可能性極大。由于此種非法添加只有在奶牛使用抗生素后才使用，就黑龍江而言，8～10月份屬于奶牛疾病低發階段，這也是檢出β-內酰胺酶較低的原因之一。為確保安全，必須加強對整個乳業產業鏈的監管。

3 結束語

基于本次乳及乳制品中β-內酰胺酶專項監測結果，雖然生乳中非法添加β-內酰胺酶為個別現象，但仍然存在個別奶農的違規現象。由于黑龍江省奶牛養殖模式仍以分散養殖為主，乳腺炎等疾病發病率高，抗生素使用不規范等特點，短期內牛奶中抗生素殘留的問題仍會普遍存在。而奶農為減小損失會設法將含有抗生素的牛乳通過加入β-內酰胺酶等方式以掩蓋抗生素殘留送交到乳品企業。所以其危害性仍不容忽視，為此建議相關部門：

一是加大監測頻次，特別是在最可能非法添加β-內酰胺酶的奶牛疾病高發期進行監測；

二是加大監管力度，使專項監測形成常態化，建議在全國范圍內開展乳和乳制品β-內酰胺酶風險監測工作，據此可及時發現非法添加β-內酰胺酶發生的重點地區與時間，為政府監管提供可靠的依據，同時也可震懾不法分子的非法添加等行為。

[1]崔生輝，李景云，馬越.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J].中國衛生食品雜志，2007,19（2）113-116.

[2]沈浥，劉洋，李兆階.乳與乳制品中β-內酰胺酶的研究進展和標準化現狀[J].中國乳品工業，2014，288，（11）：35-38.

[3]衛生部.關于印發《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》的通知（衛監督發[2009]21號）.

[4]衛生部.關于印發《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知（食品整治辦[2009]29號）.

[5]食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4.乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類藥物檢驗方法（杯碟法）.