QuEChERS-GC-MS/MS法同時測定刺梨中15種有機氯農藥殘留

李 志，冉茂乾，張馨允，蔣洪亮，徐孟懷，焦彥朝*

（1.六盤水市山地特色生態產品研究中心，貴州 六盤水 553000；2.貴陽海關出入境檢驗檢疫綜合技術中心 國家果蔬檢測重點實驗室（六盤水），貴州 六盤水 553000；3.貴陽海關出入境檢驗檢疫綜合技術中心，貴州 貴陽 550081）

刺梨（Rosa roxbunghiiTratt）又名九頭鳥、文先果，是一種稀有的果實，主要分布在貴州、四川、湖北、云南等地[1-5]，果實富含維生素、糖、有機酸、胡蘿卜素，尤其是維生素C含量極高，被稱為“維C之王”[6-9]。目前在貴州已有大面積人工種植，為培育出品質優良的刺梨，農藥被廣泛應用于農產品的除蟲殺菌，然而因存在農藥的不合理使用，農產品中經常存在農藥殘留超標的情況被檢出，食品中殘留小劑量的農藥和其他化學試劑會對人和動物的健康產生不良影響，因此食品中農藥殘留已經成為威脅消費者的一大安全問題。農藥多殘留分析QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe）方法是用于高含水量食物中農藥多殘留檢測的一種樣品處理和凈化技術[10-14]。近年來國內外已有大量文獻研究QuEChERS方法作為農獸藥殘留檢測的前處理，劉婷等[15]采用QuEChERS結合氣相色譜-三重四級桿串聯質譜法（gas chromatography triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）和液相色譜-串聯質譜法（liquidchromatographytandemmassspectrometry，LC-MS/MS）對果蔬農藥多殘留進行分析研究；高彥等[16]采用QuEChERS結合LC-MS/MS法在動物源性食品中獸藥殘留分析中的應用研究；CONCHA-MEYER A等[17]使用QuEChER結合GC-MS/MS對智利國內市場冷凍水果和蔬菜中的農藥殘留進行分析研究；本研究建立QuEChER前處理結合氣相色譜-三重四級桿串聯質譜法（GC-MS/MS）對刺梨中15種有機氯農藥殘留進行同時檢測，為刺梨農藥殘留檢測提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨（貴農一號）、刺梨（貴農七號）、刺梨（貴農九號）：市售；乙腈、正己烷（色譜純）：德國Merck公司；丙酮、甲苯（色譜純）：美國Tedia試劑公司；硅藻土、氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）：均購于德國Dr.Ehrenstorfe公司；ECQUEU750CT-MP 萃取鹽包（4 g MgSO4，1 g NaCl，0.5 g檸檬酸二鈉和1 g檸檬酸三鈉）：美國Agilent公司；PestiCarb/NH2柱：上海譽譜化工科技有限公司。

α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、百菌清、艾氏劑、狄氏劑、o,p'-滴滴伊、o,p'-滴滴滴、p,p'-滴滴涕、p,p'-滴滴滴、噠螨靈、三氯殺螨醇、硫丹，規格均為（100 μg/mL、1.2 mL）：北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TQ8050氣相色譜-質譜聯用儀（配AOC-20i+s自動進樣器）：日本島津公司；TT-2500-VM型多管渦旋混合器：北京金恒祥儀器有限公司；5427 R臺式高速冷凍離心機：Eppendorf（中國）有限公司；HG200均質機：普利賽斯國際貿易（上海）有限公司；AUX220分析天平：日本島津公司；EYELA旋轉蒸發儀：東京理化器械株式會社；HSE-12B固相萃取儀：天津市恒奧科技發展有限公司；TWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喆圖科學儀器有限公司；retsch混合型碾磨儀MM 400：德國ReTsch萊馳公司；Thermo ASETM 150 加速溶劑萃取器：美國賽默飛公司；SCQ-5201D超聲儀：上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

QuEChERS前處理：稱取10.0 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈旋渦振蕩提取5 min后，將ECQUEU750CT-MP 萃取鹽包加入離心管中再次劇烈振蕩提取5 min，然后在20 ℃、5 000 r/min離心5 min，移取1 mL提取液至裝有150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18的2 mL微離心管中，經旋渦振蕩1 min后10 000 r/min離心5 min，取上清液至自動進樣瓶，供GC-MS/MS分析檢測。

加速溶劑萃取[18]：稱取10 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿與10 g 硅藻土混合，移入加速溶劑萃取儀的34 mL 萃取池中，在10.34 MPa 壓力、80 ℃條件下加熱5 min，用乙腈靜態萃取3 min，循環2次，然后用池體積60%的乙腈（20.4 mL）沖洗萃取池，并用氮氣吹掃100 s。萃取完畢后，氮吹濃縮至1 mL左右，將濃縮液于已用乙腈-甲苯溶液（3∶1）活化好的Sep-Pak NH2柱中凈化，并用20 mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）洗滌Sep-Pak NH2柱，凈化液于40 ℃氮吹儀濃縮至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，供GC-MS/MS分析。

超聲波萃取：稱取10.0 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿于80 mL離心管中，加入20 mL正己烷放入超聲提起儀中浸提5 min，超聲儀提取條件為：功率120 W、頻率500 kHz、溫度30 ℃。加入5 g氯化鈉，再次浸提5 min，將離心管放入離心機中，在5 000 r/min離心10 min，取上清液于旋轉蒸餾瓶中，重復提取3次，合并提取液，旋轉蒸餾濃縮至1 mL左右，將濃縮液于已用乙腈-甲苯溶液（3∶1）活化好的Sep-Pak NH2中凈化，并用20 mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）洗滌Sep-Pak NH2柱，凈化液于40 ℃氮吹儀濃縮至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，供GC-MS/MS分析。

1.3.2 氣相色譜-質譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，恒溫2 min，以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃，恒溫1 min，再以3 ℃/min的速率升溫至270 ℃，恒溫14min；進樣口溫度：280 ℃；色譜-質譜接口溫度：280 ℃；離子源溫度：300 ℃；載氣：氦氣（He），純度≥99.999%，流速1.2 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：無分流進樣，1.5 min后開閥；電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；駐留時間：2.5 min；溶劑延遲時間：3 min；采集參數：質譜多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）（參數見表1）。

表1 15種有機氯農藥組分的CAS號、多反應監測參數Table 1 CAS number and multiple reaction monitoring parameters for 15 kinds of organochlorine pesticides

續表

1.3.3 標準曲線的配制

取兩個10 mL容量瓶，其中一個容量瓶配10種混合標準中間液，另一個容量瓶配5種混合標準中間液，分別移取有機氯農藥標準液（100 μg/mL、1.2 mL）各1 mL于2個10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得質量濃度為10 μg/mL混合農藥標準中間液，放入4 ℃冰箱中冷藏，有效期3個月。

分別移取標準中間液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得質量濃度為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL的標準工作液。按照1.3.2節氣相色譜-質譜條件進行分析，以濃度為橫坐標，定量離子對的峰面積為縱坐標進行線性回歸。

1.3.4 不同溶劑對各組分響應值的影響

樣品中殘留農藥的提取是食品中農藥殘留分析檢測的關鍵環節，選擇一個好的提取溶劑是保證農藥殘留檢測準確性的前提條件，因此對樣品殘留農藥提取溶劑盡可能選擇能充分提取樣品所含農藥成分及其代謝產物，而又盡量少提取樣品中其他干擾物質。按照1.3.1 QuEChERS前處理，考察乙腈、正己烷、二氯甲烷3種不同提取溶劑對刺梨中15種待測物提取效率。

1.3.5 不同凈化劑對各組分響應值的影響

蔬菜水果中的色素、碳水化合物、有機酸等的凈化程度會影響樣品的回收率。目前QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等，不同類型的凈化劑對最終待測物的提取效率有顯著影響，選取PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合作為凈化劑，按1.3.1 QuEChERS前處理，考察不同凈化劑對刺梨的凈化效果。

1.3.6 分析條件的優化

為進一步得到最優分析條件，分別選取不同萃取方法、正己烷萃取體積、PSA-C18不同配比組合吸附劑作為分析條件的3因素3水正交試驗，試驗設計見表2。

表2 檢測條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for determination conditions optimization

1.3.7 方法的回收率與精密度試驗

選取空白刺梨樣品基質進行加標回收試驗，分別準確添加25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個濃度水平的15種有機氯農藥混合標準溶液，按照1.3.1 QuEChERS前處理，每個濃度做6平行樣品，回收率與精密度如表5所示。

2 結果與分析

2.1 15種有機氯農藥混標溶液總離子流色譜圖

圖1 15種有機氯農藥標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of 15 kinds of organochlorine pesticide standards

2.2 15種有機氯農線性關系及方法檢出限

以空白基質產生的3倍信噪比（S/N）計算檢出限[19-20]，15種有機氯農藥保留時間、線性回歸方程、相關系數及檢出限見表3。由表3可知，15種有機氯農藥在0.05～1.00 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.997，檢出限0.001 2～0.021 2mg/kg。

表3 15種有機氯農藥的保留時間和線性回歸方程及相關系數Table 3 Retention times,linear regression equations and correlation coefficients of 15 kinds of organochlorine pesticides

2.3 提取方法的比較

超聲波萃取是基于超聲波的特殊物理性質，主要是通過電壓換能器產生的快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品之間的作用力，從而實現固-液萃取分離；QuEChERS萃取是一種適用于高含水量食物中農藥多殘留檢測的樣品處理和凈化技術，簡化了以前繁雜的萃取步驟并且擴大了所萃取農殘的范圍，因此在食品分析方法中得到了廣泛應用；加速溶劑萃取是一種全新的處理固體和半固體樣品的方法，通過升高萃取過程溫度，提高萃取壓力來實現快速、高效的萃取。由圖2可知，超聲波萃取、QuEChERS萃取、加速溶劑萃取各化合物回收率均在70%～110%，滿足農藥加標回收率要求。

圖2 不同提取方法對回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction methods on recovery rates

2.4 提取溶劑的選擇

農藥殘留提取溶劑的選擇應遵循“相似相溶”原理，應選擇與待測農藥極性相似的溶劑作為提取液，有機氯農藥極性較弱應選擇極性弱的溶劑作為提取液。由圖3可知，乙腈、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑時，其平均回收率分別是89.07%、90.93%、81.80%；乙腈沸點較高，不利于濃縮，且價格較為昂貴，對一些熱穩定性較差的有機氯農藥提取效率有較大影響；二氯甲烷極性較強，其提取平均回收率相對較低，且二氯甲烷毒性較大，不利于實驗人員的健康；故選正己烷作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on recovery rates

2.5 凈化劑種類的選擇

QuEChERS方法中最常用的三種凈化吸附劑是PSA、GCB、C18。C18凈化劑疏水性極強，能夠有效去除樣品中的脂肪酸和色素，同時它對非極性化合物具有較強的吸附作用[10]；PSA對樣品基質中各種色素、有機酸以及一些脂肪酸和糖具有良好凈化效果[14]；GCB可以有效的凈化基質中類甾體、葉綠素等色素，但對脂肪的凈化能力較差，且具有較強的吸附性，使一些農藥不易洗脫，從而影響分析結果。為了能有效去除刺梨中雜質的干擾，本研究分別考察了PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合凈化劑對刺梨中15種有機氯農藥回收率的影響，結果見圖4，PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合凈化劑對刺梨凈化效果的平均回收率分別82.27%、88.73%、81.40%，因此選擇PSA-C18（1∶1）組合作為本實驗的凈化劑。

圖4 不同凈化劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different purifying agents on recovery rates

2.6 分析條件的優化

分別選取不同萃取方法、正己烷體積、PSA-C18組合凈化劑配比作為分析條件的3個影響因素，設計了3因素3水平的正交試驗，試驗結果及極差分析見表4。由表4可知，最優分析條件為QuEChERS作為樣品前處理、正己烷體積為20 mL、凈化劑為PSA（50 mg）-C18（50 mg）。按該條件進行3次平行驗證試驗，刺梨中15種有機氯農藥的平均回收率為98.87%，優于其他試驗條件所得的回收率，因此確認該方法為刺梨農藥殘留檢測的最優分析條件。

表4 刺梨中有機氯農藥殘留檢測條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for determination conditions optimization of organochlorine pesticide residues in Rosa roxbunghii Tratt

2.7 回收率與精密度試驗結果

由表5可知，15種有機氯農藥的平均回收率為81.98%～105.55%，精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.23%～6.98%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》相應參數要求，表明該檢測方法科學可行。

表5 15種有機氯農藥回收率及精密度試驗結果Table 5 Recovery rates and precision tests results of 15 kinds of organochlorine pesticides

續表

2.8 實際樣品分析結果

采用該方法檢測三種刺梨中15種有機氯農藥，檢測結果見表6。由表6可知，貴農一號刺梨、貴農七號刺梨中檢測農藥分別有2種呈陽性，分別是五氯硝基苯0.030 8 mg/kg、噠螨靈0.0581mg/kg、百菌清0.0653mg/kg、硫丹0.0397mg/kg；貴農九號刺梨中只有一種農藥呈陽性：α-六六六0.0235mg/kg。

表6 刺梨樣品中15種有機氯農藥的檢測結果Table 6 Determination results of 15 kinds of organochlorine pesticides in Rosa roxburghii Tratt samples

3 結論

建立QuEChERS-GCMS/MS法測定刺梨中15種有機氯農藥殘留的快速檢測分析方法，該方法具有經濟、快速、靈敏和足夠精確等優勢；且具有良好的線性關系、加標回收率均在81.98%～105.55%之間、儀器檢出限（S/N=3）均在0.001 2～0.021 2 mg/kg區間，回收率的相對標準偏差（n=6）均小于10%，與其他農藥殘留檢測方法比，具有提取效率高、溶劑用量少、操作簡單等優勢，在實際刺梨農藥殘留檢測中得到了廣泛應用，能滿足日常的刺梨農藥殘留分析檢測。