嗜鹽單胞菌的分離及其胞外黏性代謝物的分析

劉翠華，李 娟，齊兵兵，賈士儒，呂和鑫*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制工程技術(shù)中心，天津 300457）

嗜鹽菌是一類生長(zhǎng)在海洋、鹽湖、腌制品等高鹽環(huán)境中的微生物[1]。根據(jù)微生物的嗜鹽程度，可分為四大類，即非嗜鹽菌（最適生長(zhǎng)鹽度即氯化鈉濃度＜0.2 mol/L）、弱嗜鹽菌（最適生長(zhǎng)鹽度為0.2～0.5 mol/L）、中等嗜鹽菌（最適生長(zhǎng)鹽度為0.5～2.5 mol/L）和極端嗜鹽菌（最適生長(zhǎng)鹽度為2.5～5.2 mol/L），其中部分極端嗜鹽菌為極端嗜鹽古菌[1-2]。

嗜鹽菌作為一類新型的、極具應(yīng)用前景的微生物資源[3-4]，近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注，其具有特殊的生理結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生許多具有特殊性質(zhì)的生物活性物質(zhì)[5-6]，因此，對(duì)其研究既存在理論意義，又具有應(yīng)用價(jià)值。在理論研究方面，人們對(duì)嗜鹽菌的嗜鹽機(jī)理[7]尤其感興趣，生存在極端環(huán)境中的微生物，通常是通過(guò)調(diào)節(jié)代謝適應(yīng)其所處生境而得以存活并發(fā)揮作用；在應(yīng)用方面，其用于發(fā)酵生產(chǎn)，具有抵抗高鹽環(huán)境脅迫的能力[8]，不易污染雜菌，發(fā)酵工藝易于控制，成本較低，在高鹽污水的處理方面也發(fā)揮重要作用[9-10]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及各組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)嗜鹽微生物的研究逐漸增多。周旭華等[3]在浙江舟山地區(qū)近海和鹽湖中分離出能產(chǎn)胞外多糖的嗜鹽菌株；劉穎等[8]在大連近岸海域表層海水中分離出一株嗜鹽菌，能產(chǎn)生表面活性劑。

本研究從鹽生杜氏藻的廢棄藻液中分離篩選一株能產(chǎn)生胞外黏性代謝物的嗜鹽單胞菌，研究不同NaCl濃度、pH值、溫度對(duì)其細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）掃描分析胞外產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀分析胞外產(chǎn)物主要組成成分，旨在發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌新種、開(kāi)發(fā)新型天然活性物質(zhì)，為嗜鹽微生物代謝機(jī)制研究及其代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[11]：Tris-HCl（1 mol/L）10 mL，NaCl 60 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（LB-60）[12]：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 60 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.5。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津化學(xué)試劑一分廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（≥99.9%）：美國(guó)Sigma公司；甲氧基銨鹽酸鹽（色譜純）：瑞士Buchs等公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；FD-1真空冷凍干燥機(jī)：上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；GC7890/MS5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250-Gb恒溫培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；CX40RF200系統(tǒng)顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

取1 mL鹽生杜氏藻培養(yǎng)廢棄液，按10倍梯度系列稀釋后，取100 μL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，待平板中長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落接種于LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，以產(chǎn)生黏性代謝物的菌株為目的菌株。將菌液與體積分?jǐn)?shù)為60%的甘油按體積比1∶1混合，于-80 ℃保藏。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株按1%（V/V）的接種量接種于LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。取少量菌液按10-1、10-2、10-3梯度稀釋，吸取100 μL稀釋液涂布于LB-60固體平板中，30 ℃靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，觀察菌落形態(tài)。取適量菌液涂布于載玻片并過(guò)火固定，制成臨時(shí)裝片，進(jìn)行革蘭氏染色[13]，使用顯微鏡觀察菌株染色狀態(tài)。

將菌株按1%（V/V）的接種量接種于LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心5 min，收集菌體，生理鹽水清洗3次，離心，將菌體重懸浮于2.5%戊二醛中，4 ℃過(guò)夜處理；離心，收集菌體，雙蒸水（ddH2O）清洗兩次，分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、70%的乙醇和無(wú)水乙醇梯度洗脫10 min，待乙醇揮發(fā)完全后，真空冷凍干燥12 h，取菌體粉末進(jìn)行電鏡掃描（scanning electron microscope，SEM）[14]，觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

（2）分子生物學(xué)鑒定

將篩選到的菌株接種于含有5 mL LB-60培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。以菌株基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為模板，對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），所用引物為細(xì)菌通用引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1429R：5'-GGTTACCTTGT TACGACTT-3'）。PCR擴(kuò)增體系：TaqMix 12.5 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，菌液1 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL；PCR擴(kuò)增條件參照賈宇聲等[14]的方法。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)合格后送至蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology informa tion，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)搜索[15]，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，使用MEGA5.05軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[16-17]。

1.3.3 菌株的生長(zhǎng)特性

種子液的制備：將保藏的菌株劃線于LB-60固體平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于含有50 mL LB-60的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，作為種子液。

生長(zhǎng)曲線：按1%（V/V）的接種量將種子液轉(zhuǎn)接于LB-60培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm）[2]，以發(fā)酵時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

NaCl含量及初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將菌株按1%（V/V）的接種量分別接種于不同NaCl含量（0、5 g/L、15 g/L、24 g/L、60 g/L、120 g/L、180 g/L、240 g/L）、不同初始pH值（2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0）的LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃、180r/min培養(yǎng)24h，于波長(zhǎng)600nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將菌株按1%接種量接種于LB-60培養(yǎng)基，置于不同溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）條件下培養(yǎng)24 h，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。

1.3.4 菌株胞外黏性代謝物的分析

胞外黏性代謝物的收集：按1%（V/V）的接種量將種子液接種于LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，每組三個(gè)平行，每隔5 d取樣，10 000 r/min離心10 min，去除菌體，收集發(fā)酵液中的黏性代謝物，蒸餾水清洗3次，真空冷凍干燥，稱質(zhì)量（胞外黏性代謝物產(chǎn)量），備用。

FT-IR檢測(cè)黏性代謝物成分：取1～2 mg樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描[18-19]，分析其主要的官能團(tuán)及特點(diǎn)。

GC-MS檢測(cè)黏性代謝物組分：稱取10 mg樣品于安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液6 mL，110 ℃反應(yīng)20 h左右。反應(yīng)結(jié)束后，10 000 r/min離心5 min，收集上清液，取900 μL上清液于1.5mLEP管中，真空冷凍干燥。加入5μL1.5mg/mL氘標(biāo)記的琥珀酸，渦旋混勻3 min，加入100 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），渦旋，使樣品充分溶解，40 ℃反應(yīng)80 min；加入160 μLN-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（methyl-trimethyl-silyl-trifluoroacetamide，MSTFA），混勻，40 ℃反應(yīng)80 min；衍生化后，12 000 r/min離心5 min；取上清液100 μL 裝于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)[20-22]。定性分析使用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)。定量分析采用面積歸一化法，計(jì)算物質(zhì)的相對(duì)含量[21-22]，具體計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)黏性代謝物嗜鹽菌株的分離

逐一挑取分離平板上的單菌落于LB-60培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d。其中菌株YZ1產(chǎn)生胞外黏性代謝物，故選取菌株YZ1作為目的菌株。

2.2 菌株YZ1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株YZ1的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)及掃描電鏡結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株YZ1在LB-60固體培養(yǎng)基中，菌落呈圓形，凸起，白色或乳白色不透明，表面光滑濕潤(rùn)無(wú)褶皺，不產(chǎn)生孢子，不易挑起；經(jīng)革蘭氏染色后，呈紅色，細(xì)、短桿狀；菌株YZ1在電鏡下（10 000×）呈細(xì)桿狀，單個(gè)存在，部分菌體成對(duì)縱向連接，菌體表面光滑，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)生孢子。根據(jù)染色與形態(tài)觀察結(jié)果，初步鑒定菌株YZ1為革蘭氏陰性桿菌。

圖1 菌株YZ1的菌落形態(tài)（a）、細(xì)胞形態(tài)（b）及掃描電鏡（c）結(jié)果Fig.1 Colonial morphology (a),cell morphology (b) and scanning electron microscope results (c) of strain YZ1

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株YZ1 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為1 600 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，純化后進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)搜索，發(fā)現(xiàn)菌株YZ1與Halomonas subterraneastrain ZG16同源性最高，達(dá)99.3%。利用MEGA5.05軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株YZ1與Halomonas subterraneastrain ZG16（登錄號(hào)：NR044116.1）聚于同一分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定菌株YZ1為Halomonas subterranea。

圖2 菌株YZ1 16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Results of agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products of strain YZ1

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株YZ1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain YZ1 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株YZ1的生長(zhǎng)特性

2.3.1 菌株YZ1的生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌數(shù)量、生長(zhǎng)狀況、代謝情況等多種重要指標(biāo)，是研究細(xì)菌的一項(xiàng)基本特征。菌株YZ1的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株YZ1的遲緩期為0～12 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12～28 h，穩(wěn)定期為28～48 h，48 h后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。確定菌株YZ1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)確定取樣時(shí)間及胞外黏性產(chǎn)物的產(chǎn)出時(shí)間提供重要的參考。

圖4 菌株YZ1的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain YZ1

2.3.2 不同NaCl含量對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響

不同NaCl含量下菌株YZ1的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖5。由圖5可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度＜5 g/L之前，菌株基本不生長(zhǎng)，隨NaCl質(zhì)量濃度的升高，菌體濃度不斷增大，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為60g/L和120g/L時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大，之后菌體生長(zhǎng)與NaCl質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。故菌株YZ1可在15～240 g/L NaCl質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)，最適NaCl質(zhì)量濃度為30～150 g/L。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23]，中度嗜鹽菌的最適生長(zhǎng)鹽濃度為0.5～2.5 mol/L，故菌株YZ1為中度嗜鹽菌。

圖5 不同NaCl含量對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different NaCl concentrations on strain YZ1 growth

2.3.3 不同初始pH值對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響

不同初始pH值對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)初始pH值＜4.0之前，菌株YZ1基本不生長(zhǎng)，隨初始pH值的升高，菌株YZ1生長(zhǎng)加快；當(dāng)初始pH值為7～8時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大值，之后生長(zhǎng)速率開(kāi)始降低；當(dāng)初始pH值達(dá)到12時(shí)，細(xì)菌基本停止生長(zhǎng)，故菌株YZ1可在弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)初始pH值為7～8。

圖6 不同初始pH值對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different initial pH on strain YZ1 growth

2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，菌株在20～40 ℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，且隨培養(yǎng)溫度升高，菌株生長(zhǎng)加快，45 ℃基本不生長(zhǎng)，故菌株YZ1的最適生長(zhǎng)溫度為30～40 ℃，不耐高溫。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株YZ1生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of different culture temperature on strain YZ1 growth

2.4 菌株YZ1胞外黏性代謝物分析

2.4.1 胞外黏性代謝物產(chǎn)量的變化

每隔5 d收集胞外黏性代謝物（見(jiàn)圖8a），該產(chǎn)物在水中溶解性較差或不溶解，松散不緊實(shí)，水分含量較高。真空冷凍干燥后見(jiàn)圖8b。干質(zhì)量隨時(shí)間的變化情況見(jiàn)圖9。由圖9可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，胞外黏性代謝物的產(chǎn)量不斷積累，至30 d基本達(dá)到穩(wěn)定，最高可達(dá)約20 g/L。

圖8 菌株YZ1胞外黏性代謝物Fig.8 Extracellular viscous metabolites of strain YZ1

圖9 菌株YZ1胞外黏性代謝物的積累量Fig.9 Accumulation of extracellular viscous metabolites of strain YZ1

2.4.2 FT-IR分析胞外黏性代謝物主要官能團(tuán)組成

利用FT-IR掃描胞外黏性代謝物在波數(shù)400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的光譜圖，分析物質(zhì)中主要化學(xué)能團(tuán)組成，掃描結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，在波數(shù)3 425 cm-1處有一寬吸收峰，這是糖環(huán)中的-OH伸縮振動(dòng)所致，此區(qū)域吸收峰的寬度和大小表明氫鍵的長(zhǎng)度和取向的大小；在波數(shù)2 922 cm-1處的小吸收峰，為C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)所致，此吸收峰與糖的特征吸收峰相對(duì)應(yīng)；在波數(shù)1 639 cm-1處的吸收峰，為羧酸鹽的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)所致，此處的吸收峰與蛋白質(zhì)的特征吸收峰相對(duì)應(yīng)；在波數(shù)1 452 cm-1，1 406 cm-1和1 238 cm-1處的弱吸收峰，為C-H變形振動(dòng)所致；在波數(shù)1 087 cm-1處的吸收峰，為糖及其衍生物彎曲振動(dòng)所致，該處的譜帶歸屬于糖苷鍵，是糖的特征吸收峰[24-25]。由此可以判斷該胞外黏性代謝產(chǎn)物中含有糖類、蛋白質(zhì)及其分別對(duì)應(yīng)的衍生物或聚合物等，成分復(fù)雜，物質(zhì)種類較多。

圖10 菌株YZ1胞外黏性代謝物傅里葉變換紅外光譜圖Fig.10 Fourier transform infrared spectroscopy of extracellular viscous metabolites of strain YZ1

2.4.3 GC-MS檢測(cè)胞外黏性代謝物組分

利用GC-MS對(duì)菌株YZ1胞外黏性代謝產(chǎn)物的組成成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，共檢測(cè)到59種組分，包括22種氨基酸、10種糖類、8種脂肪酸、3種胺類、4種醇類、5種酸類、1種烷類及6種其他類物質(zhì)。其中氨基酸、糖類和脂肪酸含量較高，如谷氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸、D-半乳糖、棕櫚酸、硬脂酸等。結(jié)合紅外光譜掃描的結(jié)果，蛋白質(zhì)及糖類特征官能團(tuán)的對(duì)應(yīng)峰明顯，故可以推測(cè)該胞外產(chǎn)物主要成分為糖蛋白或脂蛋白類物質(zhì)。

表1 GC-MS檢測(cè)菌株YZ1胞外黏性代謝物的組成及含量Table 1 Composition and contents of extracellular viscous metabolites of strain YZ1 detected by GC-MS

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究從鹽生杜氏藻培養(yǎng)廢棄液中篩選得到一株能夠產(chǎn)生胞外黏性代謝物的嗜鹽菌YZ1，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為Halomonas subterranea。菌株YZ1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12～28h，最適生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量濃度為30～150g/L，最適生長(zhǎng)初始pH值為7.0～8.0，最適生長(zhǎng)溫度為30～40 ℃。菌株YZ1發(fā)酵30 d 時(shí)，胞外黏性代謝物產(chǎn)量為20 g/L，初步鑒定其主要成分為糖蛋白或脂蛋白類物質(zhì)。