黑根霉Q3Y在旱脅迫效應下的菌絲生長特性及糖化產物

楊云娟，錢 紅，車云巧，肖 伶，郭海靜，蘇艷歡，周 瑋，唐湘華，黃遵錫*

（1.云南師范大學 生命科學學院，云南 昆明 650500；2.云南師范大學 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500；3.云南省酶工程技術研究中心，云南 昆明 650500）

根霉菌[1]為毛霉科，根霉屬，是自然界中廣泛存在的一類真菌，為我國數種傳統發酵食品的重要優勢菌[2]，被大量用于米酒、黃酒的糖化過程[3-4]。根霉在生長過程中能產生大量的淀粉酶、糖化酶[5-6]、蛋白酶[7]、脂肪酶[8-10]，而且還能產生蘋果酸、富馬酸、乳酸、琥珀酸等有機酸[11-13]，被廣泛應用于醫藥、食品、化工和能源等眾多領域[14-15]。

根霉為絲狀真菌，能在固態培養模型下生長，以頂端細胞延伸和分枝進行生長，根霉菌絲延伸過程中受到培養基的含水量和蓬松程度的影響[16]，氣生菌絲容易形成孢子，導致固態培養載體上生長不均，形成的代謝產物差異性較大[17]。

根霉菌的固態發酵，其種子質量成為固態發酵成功的重要指標。而使用的種子常采用液態種子和固態種子[18]。固態種子在培養過程中經常出現種子污染問題和菌絲過早產生孢子現象，同時還會伴隨著黑曲霉、青霉、細菌的污染。而液態培養根霉，根霉菌絲生長在水中由于受阻力小，菌絲延伸容易，形成的菌絲體也比較粗壯，但培養后期菌體容易受搖床的回旋作用導致菌絲容易纏繞成團，呈絮凝團狀，菌絲體分散度差，作為液體種子會導致接種不均勻，菌絲生長不均衡，代謝產物差異較大，不利于作為固態發酵的液體種子使用。

本實驗采用黑根霉（Rhizopus nigricans）Q3Y作為實驗菌株，通過液體發酵方式，調節液體發酵液中的游離水，以瓊脂多糖吸水特性，吸附游離水形成膠體物，形成缺水現象，模擬固態發酵模式，研究該菌株的生長特性，分析不同黏度下菌絲生長的情況。

糯米作為一種重要的淀粉質原材料，具有黏性，加水形成的培養基黏性高，和設置的黏性液體發酵模型相類似，通過以糯米培養液為測試對象，分析了糯米發酵制糖過程中可溶性總糖、還原糖、寡糖和菌株產糖化酶的變化規律，為制備功能性發酵黑糖降低能耗和縮短操作環節，為高濃度寡糖漿[19]，功能性寡糖[20-21]的可行性制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

黑根霉（Rhizopus nigricans）Q3Y菌種：云南師范大學生命科學學院微生物實驗室保存；馬鈴薯（云南合作88）、糯米（昆明富民產地）：市售。

1.1.2 化學試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海藍季生物公司；可溶性淀粉（生化試劑）：菱湖精細化工廠；瓊脂粉、麥芽糖（均為生化試劑）：上海藍季生物公司；氫氧化鈉（分析純）：上海試驗四赫維化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：上海申博化工有限公司；無水亞硫酸鈉（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；苯酚（分析純）：重慶川東化工（集團）有限公司。

1.1.3 培養基

種子活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：新鮮土豆切塊，稱取40.0 g，加入200 mL水，放入打漿機中搗漿，裝到500 mL燒杯中，煮沸10 min，200目濾袋過濾，調節過濾液pH值為7.0，加入4.8 g瓊脂粉，攪拌后，包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121 ℃滅菌30 min，冷卻到60 ℃，每個滅菌的培養皿中倒入15.0 mL，制備PDA平板。

種子培養基：新鮮土豆切塊，稱取40.0 g，加入160.0 mL水，放入打漿機中搗漿，裝到500.0 mL的燒杯中，煮沸10 min，200目濾袋過濾，調節過濾液pH為7.0。取250.0 mL的三角瓶，每個瓶中裝入100.0 mL土豆汁溶液和0.5 g瓊脂粉，搖晃均勻后包扎，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121 ℃滅菌30 min，冷卻待用。

1.2 儀器與設備

TGL-16B高速離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；WAY-2w阿貝折光儀：上海光學儀器廠；NDJ-5S數顯黏度計：上海平軒科學儀器有限公司；XZ-J20B打漿機：中山市富卓電器有限公司；DEL7a 320 pH計：梅特勒托利多公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；MQL-621R迴轉式搖床：上海旻泉儀器有限公司；CX22LEDRFS1 奧林巴斯顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑根霉Q3Y菌種的活化及種子液的制備

菌種活化：取滅菌的PDA平板，使用接種環挑取黑根霉Q3Y表面上的孢子在平板上畫線，置于28 ℃的培養箱中培養48 h，待種子長滿整個平板，取出放在4 ℃冰箱保藏。

種子液的制備：取種子培養基，挖起平板中的菌種塊約φ2 cm，接種到種子液中，包扎好后放在28 ℃、轉速180 r/min的搖床上培養48 h。

1.3.2 黏度的測定

將黏度計用水清洗干凈且擦干，調節黏度計水平狀態，而后將2#轉子放入樣品中進行測定，記錄數值。

1.3.3 糖化酶酶活力的測定[6]

葡萄糖標準曲線的制作：配制質量濃度為1.0 mg/mL的標準葡萄糖溶液，用試管分別取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL的葡萄糖溶液，依次補水1.9 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL、1.3 mL、1.2 mL、1.1 mL、1.0 mL，再向每個試管中分別加入3.0 mL DNS溶液，放入沸水浴中煮沸5.0 min，冷卻，定容為至15.0 mL，混勻，于波長540 nm條件下測定吸光度值（OD540nm值），以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作葡萄糖標準曲線，得到回歸方程y=0.473x-0.019，相關系數R2為0.999。

糖化酶酶活定義：在50 ℃，pH 4.5的條件下，每分鐘水解10.0 mg/mL的淀粉底物溶液產生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.3.4 可溶性總糖及還原糖含量的測定

紗布過濾根霉菌株Q3Y培養液，使用移液器吸取過濾液到1.5 mL離心管中，于15 000 r/min條件下離心5.0 min，收集上清液，待用。

可溶性總糖的測定：取上清液，用阿貝折射儀進行可溶性總糖測定；

還原糖的測定：取離心上清液0.1 mL加入干凈試管中，加入1.8 mL水，加入3.0 mL DNS試劑，在沸水浴中反應5.0 min，取出冷卻，加入10.0 mL單蒸水，混合均勻；空白管中加入2.0 mL單蒸水和3.0 mL DNS試劑，在沸水浴中反應5.0 min，取出冷卻，加入10.0 mL單蒸水，混合均勻。以空白管為對照，在波長540.0 nm條件下比色，測定OD540nm值，通過葡萄糖標準曲線回歸方程計算還原糖含量。

1.3.5 土豆培養基黏度對菌株Q3Y種子生長的影響

取400 g新鮮土豆，切塊，加入400 mL水，放入打漿機中搗碎，定容至2 000 mL，煮沸，200目濾袋過濾得上清液分裝15個三角瓶，每瓶裝100.0 mL，瓊脂粉添加量分別為0、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%，每個水平重復3次，置于高壓蒸汽滅菌鍋中于0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到25 ℃，使用黏度計測定培養基的黏度。

在每瓶含20%的土豆汁培養基中分別添加瓊脂粉含量為0、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%，于121 ℃條件下滅菌30 min。待冷卻后，在超菌臺中取根霉Q3Y平板的菌絲塊（約φ2 cm）接入到三角瓶中，接種量約為3%。接種后置于28℃、180r/min條件下搖床培養35～40 h，取菌絲體通過顯微鏡觀察細胞生長情況；取發酵液在15 000 r/min條件下離心5.0 min，取上清液測定還原糖及可溶性總糖含量。

1.3.6 糯米原料發酵分析

取8個300 mL三角瓶，糯米與蒸餾水的料水比分別為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL），配制含水量為90.0%、83.3%、77%、71.4%、66.7%、62.5%，58.8%和55.0%的糯米培養基。將糯米培養基放置于0.1 MPa、115 ℃條件下蒸煮40 min，冷卻至30 ℃，觀察分析不同水分含量的糯米培養基的黏稠性及吸收膨脹狀態。

取8個2 L的不銹鋼盆，做好標記，糯米與蒸餾水的料水比分別為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL），攪拌混勻使用紗布封口包扎，在115.0 ℃滅菌40.0 min，取出冷卻，按糯米質量的10%接種量接種菌株Q3Y種子液，攪拌使糯米與黑根霉Q3Y菌種充分混合均勻，然后用保鮮膜密封盆口，放置于28 ℃恒溫培養，培養24 h后，每隔12 h 取樣測定發酵液中的pH、可溶性總糖及酶活力。

2 結果與分析

2.1 不同瓊脂粉添加量對土豆汁培養基黏度的影響

圖1 瓊脂粉添加量對土豆汁培養基黏度的影響Fig.1 Effect of agar powder addition on viscosity of potato juice medium

由圖1可知，土豆汁培養基起始黏度僅有100 mPa·s，由于黏度低，培養液濁度較清，形成的菌絲體生長較差；隨著瓊脂粉添加量增加，培養基的黏度快速增加；瓊脂添加量為0.50%時，溶液黏度為500 mPa·s，根霉菌絲生長狀態良好，菌懸液均勻，菌絲細膩，分散均勻，非常有利于液態培養根霉Q3Y菌株的生長；瓊脂添加量為1.00%土豆汁培養基的黏度達到了2 500 mPa·s，液體的流動性變得非常差，發現黏度過大的土豆培養基中根霉菌絲體生長較差，而在添加瓊脂少的培養液中成團，分散度弱，菌絲均勻度也是非常差。因此，通過適當增加黏度，提高溶液的張力，提高游離水的飽和度，無自由析出，模擬干旱脅迫效應，容易加速根霉菌絲細胞的深層培養，大量的菌絲細胞成為基內菌絲體，不易產生氣生孢子。

2.2 土豆汁培養基黏度對菌株Q3Y細胞生長的影響

為了研究根霉在高黏度固態培養中菌絲生長狀況及延伸情況，本實驗在所使用的土豆培養基中添加了一定的瓊脂，模擬糯米黏度的特性，讓根霉在不同黏度的培養基中進行培養，結果見表1。由表1可知，在不同黏度的培養基中，種子的生長狀況有所差異。4種不同黏度的培養基在種子的培養過程中，所產生的總糖和pH相差不大，但在菌絲生長形態上有著一定的差異。無添加瓊脂的培養基和添加瓊脂為0.10%形成的黏性培養基，其菌絲細胞較小，這可能是因為菌體在振蕩培養過程中，由于培養液濁度較清，菌絲比較容易發生斷裂，根霉菌具有一定的黏附性，在濁度較輕的培養液中，根霉菌的菌絲容易成團生長，不易分散，因此此種培養基黏度下，菌絲細胞較小。添加瓊脂為0.50%的培養基黏度，能使根霉菌絲體的生長狀態比較理想，通過顯微鏡觀察可得，此黏度下的菌絲細胞比較均勻，這樣可以使其更加容易在固態的培養基中延伸生長。因此，選擇添加0.50%瓊脂的土豆培養基更適于黑根霉Q3Y菌株的生長。

表1 培養基黏度對黑根霉Q3Y菌絲生長的影響Table 1 Effect of medium viscosity on the mycelia growth of Rhizopus nigricans Q3Y

2.3 糯米原料發酵分析

2.3.1 不同含水量糯米的物理特性

不同含水量的糯米物理特性分析結果見表2。由表2可知，含水量為58.8%和62.5%的糯米黏稠性和膨松度較好，顆粒軟硬度適中，容易成團，有利于霉菌的生長，在該水分下的糯米特性屬于固態發酵的特性，沒有游離水，適合于根霉的生長。因此，根據糯米含水量的特性，為便于黑根霉的菌絲延伸及其生長，選擇料水比為6∶10（g∶mL）（含水率62.5%）和7∶10（g∶mL）（含水率58.8%）的糯米培養基進行菌種發酵。

表2 不同含水量糯米的物理特性Table 2 Physical properties of glutinous rice with different water contents

2.3.2 不同含水量糯米培養基發酵產物及原料利用率分析

實驗設計了在相同接種量、培養溫度條件下，根霉在料水比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、7∶10、8∶10（g∶mL）的熟糯米培養基上的進行發酵培養，通過對可溶性總糖和還原糖的測定，分析了根霉生長對糯米淀粉的利用及原料利用率的影響，結果見圖2。由圖2a和2b可知，隨著根霉菌培養時間的延長，伴隨著菌絲細胞的延伸，糯米中的淀粉多糖被菌絲細胞水解形成水溶性多糖和還原糖，在料水比為6∶10（g∶mL）的發酵液中，當培養時間達到72 h時，可溶性總糖及還原糖含量分別為32 g/100 mL、26 g/100 mL，表明大量的淀粉被水解，可溶性總糖和還原糖呈正相關性，大量的可溶性總糖被逐漸轉化為還原性單糖，這種現象也是符合根霉的雙邊發酵特性[20]，邊生長邊水解淀粉，導致淀粉原料被徹底水解成還原糖。由圖2c可知，料水比低的培養基中原料利用率最高，而在料水比為8∶10（g∶mL）的糯米培養基中，形成了高濃度糯米培養基，培養基含水率為55.6%，糯米顆粒硬，黏度高，顆粒蓬松度差，根霉生長水解72 h，原料的利用率只有14.8%。其原因主要是培養基中的糯米固形物濃度大，培養基中的游離水少，糖化酶在沒有水分子參與條件下不能進一步催化水解淀粉，導致形成的還原糖產物較少；而游離水的減少導致糖苷水解糖類的催化能力降低，不利于代謝產物糖化酶對淀粉的降解。所以料水比越高，根霉菌絲體生長就弱，細胞延伸阻力大，形成的糖化酶產量也低。所以，在進行利用根霉進行制糖工藝研究中，使用料水比為6∶10（g∶mL）和7∶10（g∶mL）的培養基有利于發酵生產。

圖2 黑根霉Q3Y發酵糯米水解產物各項指標分析Fig.2 Analysis of hydrolysis product in Rhizopus nigricans Q3Y fermentation with glutinous rice medium

2.3.3 不同含水量糯米培養基發酵糖化酶活性分析

圖3 黑根霉Q3Y發酵糯米培養基中糖化酶活力分析結果Fig.3 Analysis results of glucoamylase activity in Rhizopus nigricans Q3Y fermentation with glutinous rice medium

將種子液接種到料水比為6∶10（g∶mL）和7:10（g∶mL）的糯米中進行培養24 h后，每隔12 h取樣測定糖化酶活力，結果見圖3。由圖3可知，料水比為6∶10（g∶mL）和7∶10（g∶mL）的糯米培養液中的酶活隨培養時間的增加而增高，且兩者的產酶能力差異不大；還原糖含量隨糖化酶活力增大而增加（見圖2b），二者呈正相關。在料水比為6∶10（g∶mL）糯米培養液中，根霉發酵72 h，其糖化酶活力達到23.0 U/mL。

3 結論

本實驗采用人為設置的脅迫環境，將黑根霉Q3Y菌株置于高黏度糯米培養基中進行培養，發現根霉在添加0.5%瓊脂的培養基中生長良好，形成的培養懸浮液均勻穩定，培養后的菌絲形態分散，生物量高，菌絲細胞均勻。通過制備的種子液用于糯米發酵實驗分析，結果表明根霉菌對糯米原料的分解能力非常好；在料水比為6∶10（g∶mL），含水量為62.5%的糯米培養基中的可溶性總糖能達到32g/100mL，還原糖能達到26g/100mL。在對代謝產物糖化酶分析中發現，根霉發酵72h，其糖化酶活力能達到23.0U/mL。表明通過調節培養基的黏液，脅迫菌絲細胞朝液體深層延伸、生長，是適合菌體生長的一種理想液體發酵培養模式，有利于延長菌絲體的生長周期，減少霉菌孢子的生成，提高生物量。