辣椒醬發酵菌腸膜明串珠菌C27高密度培養條件優化

韓亞楠，程方方，武亞婷，何歡歡，宋文軍，蘇麗明，歐陽韶，楊群慧，武 運*

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.天津商業大學 天津食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一類進行異型發酵的革蘭氏陽性兼性厭氧乳酸菌，是眾多傳統發酵制品中的優勢菌群[1]，具有高產酸、抗氧化和拮抗致病菌等能力，可應用于食品、化工、醫療等領域[2]。在食品行業，尤其在辣椒醬、泡菜等發酵食品中，腸膜明串珠菌通過作用于發酵初期，快速啟動發酵，發酵糖類產生多種酸和醇，一方面賦予產品特有的風味、質地和口感，另一方面抑制了其他雜菌的生長，提高了產品的安全性[3-6]。

我國發酵辣椒醬歷史悠久，傳統發酵辣椒醬因為其發酵周期長、品質不穩定、亞硝酸鹽易累積超標而逐漸被人工接種發酵辣椒醬所取代[7-8]。人工接種發酵的關鍵在于直投式發酵劑的開發，目前作為辣椒醬發酵專用直投式腸膜明串珠菌發酵劑的研究尚鮮見報道。MRS培養基作為乳酸菌的商業培養基已經廣泛用于各種乳酸菌培養，但是不同乳酸菌菌株對營養需求不同，MRS培養基并不能使一些乳酸菌生長最大化[9-10]。發酵劑的生產和儲存是發酵產品大規模生產的關鍵環節，而優化菌種培養基進行菌種高密度培養是其中的主要環節[11-12]。

實驗室前期已利用傳統篩菌方法從酸馬乳中分離得到一株亞硝酸鹽降解率高、發酵辣椒醬風味好的腸膜明串珠菌C27[5]。在此基礎上，進一步研究腸膜明串珠菌C27高密度培養的培養基配方和培養條件，以期為辣椒醬專用腸膜明串珠菌發酵劑的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）C27：由新疆農業大學食品科學與藥學學院實驗室分離自酸馬乳。土豆、西紅柿、玉米、平菇：市售。

1.1.2 試劑

蔗糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、檸檬酸三銨、硫酸錳（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：山東玉寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

MJX-100B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TU-1810APC分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LE2002E電子天平、FE28 PLus pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將保藏的腸膜明串珠菌C27接種于10 mL MRS肉湯培養基中，于37 ℃條件下培養24 h。然后按3%（V/V）的接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃條件下培養24 h，備用。

1.3.2 菌密度測定及活菌數的測定

按1%的接種量將活化后的發酵液接種于試驗設計的培養基中，37 ℃條件下培養24 h，發酵菌液稀釋2倍，采用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。采用平板計數法[13]測定發酵液的活菌數。

1.3.3 腸膜明串珠菌C27發酵培養基配方的優化

以MRS肉湯培養基為對照（CK），考察碳源種類、氮源種類及生長因子對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響。

碳源種類對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：選擇麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖作為碳源代替MRS肉湯培養基中的葡萄糖（20 g/L），用0.10 mol/L HCl調pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發酵液，37 ℃條件下培養24 h，測定菌體密度OD600nm值，確定最佳碳源。

氮源種類對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：選擇酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨作為氮源代替MRS肉湯培養基中的氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨）（20 g/L），用0.10 mol/L HCl調pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發酵液，37 ℃條件下培養24 h，測定菌密度OD600nm值，確定最佳氮源。

不同生長因子對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：分別取玉米汁、土豆汁、平菇汁、西紅柿汁各10.00 g/L作為生長因子代替MRS肉湯培養基中的吐溫-80，用0.10 mol/L HCl調pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發酵液，37 ℃條件下培養24 h，測定菌密度OD600nm值，確定最佳生長因子。

1.3.4 腸膜明串珠菌C27發酵培養基配方優化響應面試驗[14-15]

選擇蔗糖添加量（A）、酵母浸粉添加量（B）、土豆汁添加量（C）為考察因素，以菌體密度OD600nm值（Y1）為響應值，采用中心組合設計法（centralcompositedesign，CCD）設計3因素5水平的響應面試驗，優化培養基配方，因素與水平見表1。

1.3.5 腸膜明串珠菌C27培養條件優化響應面試驗[16]

選擇培養溫度（X1）、培養基初始pH值（X2）、接種量（X3）為考察因素，菌體密度OD600nm值（Y2）為響應值，采用中心組合設計法（CCD）設計3因素5水平的響應面試驗，優化腸膜明串珠培養條件，因素與水平見表2。

表2 培養條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for culture conditions optimization

1.3.6 數據處理

利用Sigmaplot10.0及Design Expert V8.06軟件進行數據統計及分析作圖。

2 結果與分析

2.1 腸膜明串珠菌C27發酵培養基配方優化

2.1.1 最佳碳源的確定

圖1 碳源種類對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.1 Effect of carbon sources types on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖1可知，葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響不同，當蔗糖為碳源時，腸膜明串珠菌C27的菌體密度最高，OD600nm值為1.038，其次為果糖（0.624），乳糖（0.213）最低。因此，選擇蔗糖為腸膜明串珠菌C27培養基的最優碳源，這與任蕓香等[15]研究結果蔗糖是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23的最佳碳源一致，說明蔗糖更容易被吸收利用。

2.1.2 最佳氮源的確定

圖2 氮源種類對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources types on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖2可知，不同氮源對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響不同。當以酵母浸粉為氮源時，菌體密度最高，OD600nm值為0.719，相比于MRS肉湯培養基，OD600nm值是MRS肉湯培養基的1.51倍，其次是牛肉膏（0.355），蛋白胨（0.206）最低。分析原因可能是酵母浸粉中富含氨基酸及葉酸、尼克酸、鈷胺素，且在中性和酸性環境中對熱穩定[17]。因此，選擇酵母浸粉為腸膜明串珠菌C27培養基的最優氮源。

2.1.3 最佳生長因子的確定

圖3 不同生長因子對腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.3 Effect of different growth factors on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖3可知，相比于MRS肉湯培養基，土豆汁、玉米汁對腸膜明串珠菌C27的生長有明顯促進作用，其中土豆汁促進作用最大，而平菇汁、西紅柿汁對腸膜明串珠菌C27生長促進作用較小，因此，選擇土豆汁為腸膜明串珠菌C27培養基的最優生長因子。

2.1.4 腸膜明串珠菌C27發酵培養基配方優化響應面試驗腸膜明串珠菌C27發酵培養基配方優化響應面試驗

結果見表3，方差分析見表4。

表3 發酵培養基配方優化響應面試驗結果Table 3 Results of response surface tests for fermentation medium formula optimization

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert V8.06軟件對表3的數據進行多元回歸擬合，得到以OD600nm值（Y1）為目標函數的二次回歸方程：Y1=0.930+0.036A+0.025B+0.038C-0.041A2-0.030B2-0.023C2-0.031AB-9.500E-003AC+2.500E-003BC。由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明所選模型和試驗有較高的擬合度，可用于腸膜明串珠菌C27高密度培養培養基配方優化的預測。回歸模型的校正決定系數為0.990 7，說明有99.07%的數據的變異性可由此模型來解釋。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，一次項A、B、C、交互項AB、AC與二次項A2、B2、C2對結果影響均極顯著（P＜0.01），交互項BC對結果影響不顯著（P＞0.05）。

響應面圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，反映最佳參數及各參數之間的相互作用[18-20]。采用Design Expert V8.06軟件根據回歸方程式繪制響應面及等高線，結果見圖4。

圖4 蔗糖添加量、酵母浸粉添加量及土豆汁添加量交互作用對腸膜明串珠菌C27菌體密度影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sucrose addition,yeast extract powder addition and potato juice addition on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖4可知，3個響應面均為開口向下的凸型曲線，說明在選取的各因素水平范圍內，響應值（菌體密度OD600nm值）存在極大值。由Design Expert V8.06軟件分析得出，腸膜明串珠菌C27高密度培養的最優培養基配方為蔗糖添加量21.13 g/L，酵母浸粉添加量21.62 g/L，土豆汁添加量13.85 g/L。在此優化條件下，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值預測值為0.957。考慮實際操作的可行性，將最優培養基配方修訂為蔗糖添加量21 g/L，酵母浸粉添加量22 g/L，土豆汁添加量14 g/L。為驗證預測結果的可信度，在該最佳條件下重復試驗3次，得腸膜明串珠菌C27菌體密度OD600nm值實際值為0.961，與預測值基本一致，說明響應面法優化得到的腸膜明串珠菌C27高密度培養的最優培養基準確可靠，可用于指導實際生產。

2.2 腸膜明串珠菌C27培養條件優化響應面試驗

腸膜明串珠菌C27培養條件優化響應面試驗結果見表5，方差分析見表6。

表5 培養條件優化響應面分析試驗結果Table 5 Results of response surface tests for culture conditions optimization

續表

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

采用Design Expert V8.06軟件對表5的數據進行多元回歸擬合，得到以OD600nm值（Y2）為目標函數的二次回歸方程：Y2=0.95+0.099X1+0.12X2-0.04X3-0.038X12-0.18X22-0.16X32+1.750E-003X1X2-+0.025X1X3-0.057X2X3。由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明所選模型和試驗有較高的擬合度，可用于腸膜明串珠菌C27高密度培養條件優化的預測。回歸模型的校正決定系數R2Adj為0.989 6，說明有98.96%的數據的變異性可由此模型來解釋。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，一次項X1、X2、X3、交互項X1X3及二次項X12、X22、X32對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項X1X3對結果影響顯著（P＜0.05），交互項X1X2對結果影響不顯著（P＞0.05）。

采用Design Expert V8.06軟件根據回歸方程式繪制響應面及等高線，結果見圖5。

圖5 培養溫度、初始pH值及接種量交互作用對腸膜明串珠菌C27菌體密度影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between culture temperature,initial pH and inoculum on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖5可知，3個響應面均為開口向下的凸型曲線，說明在選取的各因素水平范圍內，響應值（菌體密度OD600nm值）存在極大值。由Design Expert V8.06軟件分析得出，腸膜明串珠菌C27最佳高密度培養條件為培養溫度38.38 ℃，初始pH值6.21，接種量2.37%。在此優化條件下，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值預測值為1.033。考慮實際操作的可行性，將最優培養條件修訂為發酵溫度38.4 ℃，初始pH值6.2，接種量2.4%。為驗證預測結果的可信度，在該最佳條件下重復試驗3次，得到腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值實際值為1.034，活菌數為1.30×109CFU/mL，說明響應面法優化得到腸膜明串珠菌C27高密度培養條件準確可靠，可用于指導實際生產。

3 結論

本研究以MRS肉湯培養基為基礎培養基，菌體密度OD600nm值為評價指標，采用單因素和響應面法優化得到腸膜明串珠菌C27高密度培養的最優培養基配方為：蔗糖添加量21 g/L，酵母浸粉添加量22 g/L，土豆汁添加量14 g/L；最優培養條件為培養溫度38.4 ℃、初始pH值6.2，接種量2.4%。在此優化條件下培養24 h，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值達1.034，活菌數為1.30×109CFU/mL。