嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

余奕宏，丁小娟，丁筑紅*，宋煜婷，王 翼，陳思奇，肖仕蕓，杜勃峰

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院國家林業(yè)草原局刺梨工程技術(shù)研究中心 貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）在自然界的多種動植物和細菌及真菌體內(nèi)廣泛存在[1]，可參與微生物、植物、動物和人體的大多數(shù)生化反應(yīng)，其中包括碳水化合物的代謝，釋放葡萄糖體和配基[2-4]，并在維持生物體的正常生理功能中起重要作用。β-葡萄糖苷酶在活細胞內(nèi)產(chǎn)生，并可在體外參與各類反應(yīng)，如水解果汁及果酒中芳香前體物質(zhì)產(chǎn)生香氣[5]，生產(chǎn)非離子表面活性劑烷基糖苷等[6]，從而在工業(yè)化過程中發(fā)揮重要作用[7]。

動植物來源的β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)周期較長，提取工藝相對復(fù)雜，可操作性差[8]，而通過微生物法制得的β-葡萄糖苷酶易分離純化、價格低廉、產(chǎn)量高，可滿足工業(yè)化應(yīng)用需求[9-10]。工業(yè)上常用曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，但曲霉在食品衛(wèi)生方面存在安全隱患[11]，而乳酸菌來源的β-葡萄糖苷酶對其相關(guān)產(chǎn)品的營養(yǎng)價值及其功能特性有雙重提升作用，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）β-葡萄糖苷酶可轉(zhuǎn)化人參皂苷[12-13]、大豆異黃酮糖苷[14]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），是動物腸道菌群中的重要微生物，可以調(diào)節(jié)并改善腸道中的微生態(tài)平衡[15]，還具有調(diào)節(jié)免疫[16]、減輕肥胖[17]等益生功能。目前，國內(nèi)外針對微生物來源β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉菌（Trichoderma）等，而對嗜酸乳桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及其相關(guān)技術(shù)研究鮮有報道，且在工業(yè)化生產(chǎn)中，現(xiàn)有β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量較低且活力普遍偏低，其來源的局限性及較低的產(chǎn)量制約著β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[18]。

因此，本試驗以前期獲得的β-葡萄糖苷酶活性較高的嗜酸乳桿菌GIM.1.20為研究對象，通過單因素、正交試驗、響應(yīng)面分析優(yōu)化其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，旨在提高β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量，為嗜酸乳桿菌功能的開發(fā)以及后續(xù)β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM 1.208：本實驗室前期篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣20.0 g/L，牛肉膏浸提物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，檸檬酸二胺2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，七水硫酸錳0.05 g/L，蒸餾水1.0 L，pH 6.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

刺梨培養(yǎng)基：刺梨漿15 g，蒸餾水45 mL，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（分析純）：天津市興復(fù)精細化工研究所；無水乙酸鈉（分析純）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；鹽酸（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市盛鑫源偉業(yè)貿(mào)易有限公司；碳酸鈉（分析純）：重慶江川化工（集團）有限公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）（純度＞98%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）（純度＞98%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E-201-C-9 pH復(fù)合電極：上海鴻蓋儀器有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；101-3A電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LD2X-50KBJ立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；L5S紫外-可見分光光度計：上海儀器分析儀器有限公司；SPECTRAMAX 190全波長光吸收酶標儀：美國MolecularDevices公司；TGLIOM臺式高速冷凍離心機：長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌GIM1.208菌液的制備[19]

將Lactobacillus acidophilusGIM1.208接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。吸取1 mL已活化的嗜酸乳桿菌接種于5mLMRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h，作為種子液備用。

1.3.2β-葡萄糖苷酶活力的測定

將種子液接種于培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取菌液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，稀釋至一定倍數(shù)，采用p-NPG法測定β-葡萄糖苷酶酶活[20-21]。

β-葡萄糖苷酶酶活定義：在37 ℃、pH 5.0反應(yīng)條件下，1 mL粗酶液酶解p-NPG 1 min產(chǎn)生1 μmol p-NP的酶活力，定義為一個酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3 嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的

篩選

將種子液按2%（V/V）接種量分別接種于MRS培養(yǎng)基和刺梨培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定β-葡萄糖苷酶活力，考察兩種培養(yǎng)基對Lactobacillus acidophilusGIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響。

1.3.4 嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

確定發(fā)酵培養(yǎng)基后，以葡萄糖為碳源[22-23]，考察葡萄糖添加量（0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、初始pH值（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）、CMC-Na添加量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）[24]對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響。初始發(fā)酵條件為接種量2%，料液比為1∶3（g∶mL），自然pH，37 ℃發(fā)酵24 h。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以β-葡萄糖苷酶活力（Y）為評價指標，選擇葡萄糖添加量（A）、初始pH值（B）及CMC-Na添加量（C）進行3因素3水平正交試驗，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation medium optimization

1.3.5 嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)B-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素輪換法依次考察刺梨漿與水料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、發(fā)酵溫度（25 ℃、27 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃）、發(fā)酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）及接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響。初始發(fā)酵條件為接種量2%，刺梨漿與水料液比1∶3（g∶mL），自然pH，培養(yǎng)24 h。

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以β-葡萄糖苷酶活力（Y）為評價指標，選取對結(jié)果影響顯著的因素發(fā)酵溫度（D）、接種量（E）、刺梨漿與水料液比（F）進行3因素3水平Box-Behnken試驗，因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每次試驗重復(fù)3次；采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗方案，建立數(shù)學(xué)模型并進行多元回歸分析，Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基篩選

利用MRS肉湯培養(yǎng)基和刺梨果培養(yǎng)基發(fā)酵嗜酸乳桿菌GIM 1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h后，刺梨發(fā)酵培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶活力為（3.997±0.303）U/mL，高于MRS肉湯培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶活力[（1.770±0.203）U/mL]，這可能與刺梨自身含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，這類物質(zhì)可作為嗜酸乳桿菌GIM1.208發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)物[25]，促進嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)酶。因此，選用刺梨培養(yǎng)基作為最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖添加量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可改變β-葡萄糖苷酶的作用位點而增強酶活[26]，因此，選擇葡萄糖作為碳源，考察葡萄糖添加量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當葡萄糖添加量為3%時，β-葡萄糖苷酶活力最高，為5.92 U/mL，分析原因可能是β-葡萄糖苷酶活性與發(fā)酵體系靜電性質(zhì)和酶結(jié)構(gòu)相關(guān)[27]，因此，選擇葡萄糖3%作為碳源補充。

圖1 葡萄糖添加量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.1 Effect of glucose addition on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.2.2 初始pH值對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

由圖2可知，隨著初始pH值的升高，β-葡萄糖苷酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當初始pH值為6.5時，β-葡萄糖苷酶活力達到最大，為5.54 U/mL。分析原因可能是隨著發(fā)酵體系初始pH值的變化，酶的活性位點發(fā)生變化，對酶與底物的結(jié)合有影響，降低其活性[26]。因此，選取培養(yǎng)基初始pH值為6.5。

圖2 初始pH值對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.2.3 羧甲基纖維素鈉對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

β-葡萄糖苷酶是誘導(dǎo)酶類，可溶性CMC-Na有助于β-葡萄糖苷酶活性的提高[23，28]。由圖3可知，隨著CMC-Na添加量的增加，β-葡萄糖苷酶活力呈先升高后降低的趨勢，當CMC-Na添加量為0.4%時，酶活力最高，為6.13 U/mL。因此，選擇CMC-Na添加量為0.4%。

圖3 羧甲基纖維素鈉添加量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.3 Effect of carboxymethylcellulose sodium addition on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium optimization

續(xù)表

表4 正交試驗結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，各因素對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響的主次順序為A＞C＞B，即葡萄糖添加量＞CMC-Na添加量＞初始pH值，最優(yōu)試驗組合為A2B1C2，即葡萄糖添加量3.0%，培養(yǎng)基初始pH值5.5，CMC-Na添加量0.4%。在此優(yōu)化條件下，β-葡萄糖苷酶活力為9.72 U/mL。由表4可知，補充葡萄糖和誘導(dǎo)物CMC-Na對產(chǎn)酶效果具有顯著性影響（P＜0.05），而初始pH值對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 料液比對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

水分會影響發(fā)酵過程中胞外酶的合成與分泌[29]。由圖4可知，當刺梨漿與水料液比為1∶1～1∶4（g∶mL）時，β-葡萄糖苷酶活力逐漸升高；當料液比為1∶4（g∶mL）時，β-葡萄糖苷酶活力達到最大，為12.35 U/mL；當料液比＜1∶4（g∶mL）之后，β-葡萄糖苷酶活力呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇最佳料液比為1∶4（g∶mL）。

圖4 料液比對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.4 Effect of material to liquid ratio on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.3.2 發(fā)酵溫度對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

由圖5可知，當發(fā)酵溫度為25～30 ℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高，嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力呈上升趨勢，這可能是因為溫度升高提高了質(zhì)膜的通透性和代謝反應(yīng)的速度[30]，利于細胞內(nèi)外環(huán)境之間的養(yǎng)分運輸和產(chǎn)物交換。當發(fā)酵溫度為30 ℃時，其酶活性達到最大值，為15.15 U/mL。當發(fā)酵溫度高于30 ℃之后，β-葡萄糖苷酶活力下降[31-32]。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.3.3 發(fā)酵時間對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

由圖6可知，當發(fā)酵時間＜24 h之前，酶活性增加；當發(fā)酵24 h時，酶活力達到最大，為15.33 U/mL；當發(fā)酵時間＞24 h之后，酶活性呈現(xiàn)緩慢降低趨勢。此時微生物生長至衰亡期，代謝減弱、酶活性降低，且發(fā)酵后期，微生物次級代謝產(chǎn)物不斷積累，抑制了嗜酸乳桿菌產(chǎn)酶而降低酶活性[33]。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為24 h。

圖6 發(fā)酵時間對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.3.4 接種量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

接種量過少或過多都不利于β-葡萄糖苷酶的合成[20，34]。由圖7可知，當接種量＜2.5%之前，β-葡萄糖苷酶活力逐漸升高；當在接種量為2.5%時，β-葡萄糖苷酶活性達到最大，為15.85 U/mL；當接種量＞2.5%之后，隨著培養(yǎng)基內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏，β-葡萄糖苷酶活力緩慢減小。因此，選擇最佳接種量為2.5%。

圖7 接種量對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208

2.3.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析見表5，方差分析見表6。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization

采用Design Expert 8.0.6軟件對表5的結(jié)果進行多元二次回歸擬合，得到β-葡萄糖苷酶活力（Y）與發(fā)酵溫度（D）、接種量（E）、料液比（F）的二次多項回歸方程：Y=-86.43+3.94D+16.16E+10.45F+0.05DE-0.01DF+0.17EF-0.06D2-3.61E2-1.30F2。

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明回歸方程擬合效果較好，模型選擇恰當。決定系數(shù)R2=0.952 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.988 0，說明預(yù)測值與實際測定值間存在較好的相關(guān)性，模型選擇正確，可用此模型對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行預(yù)測。一次項D及二次項D2、E2、F2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項E對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

采用Design Expert 8.0.6軟件對模型進行優(yōu)化求解，以β-葡萄糖苷酶活力為響應(yīng)值，得到嗜酸乳桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31.24 ℃、接種量2.57%、料液比1∶4.02，在此最優(yōu)條件下，最大酶活力預(yù)測值為16.81 U/mL。為便于實際操作，將最優(yōu)發(fā)酵條件修訂為發(fā)酵溫度31 ℃、接種量2.6%、料液比1∶4（g∶mL），在此最優(yōu)條件下重復(fù)試驗6次，得到β-葡萄糖苷酶活力實際值為16.80 U/mL，與模型預(yù)測值相近，可知該模型對嗜酸乳桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的情況有較為準確的預(yù)測，證明了響應(yīng)面優(yōu)化對嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過單因素試驗及正交試驗確定嗜酸乳桿菌GIM1.208產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖添加量3.0%，羧甲基纖維素鈉添加量0.4%，初始pH值5.5；通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗確定最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間24 h，接種量2.6%，料液比1∶4（g∶mL）。在此最優(yōu)條件下，β-葡萄糖苷酶活力達16.80 U/mL，是優(yōu)化前酶活力（4.30 U/mL）的3.90倍。本試驗結(jié)果為今后通過生物技術(shù)手段產(chǎn)β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供了新的候選菌株，并為嗜酸乳桿菌功能及應(yīng)用價值的提升提供了理論參考。