響應面法優化發酵青梅酒澄清工藝

陳銘中，劉志芳，吳海珍，陳 勇，馮琳燕，鐘旭美*

（陽江職業技術學院 食品與環境工程系，廣東 陽江 529566）

青梅廣泛分布于我國廣東、浙江、江蘇、廣西、云南、福建等地。青梅果不僅營養豐富還具有獨特的藥用價值，有研究表明青梅有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、代謝調節、抗骨質疏松、免疫增強等作用[1]；除此之外青梅是天然的保健劑，用八九成熟的青梅發酵的酒能促進新陳代謝，延緩衰老，清除體內自由基，抗氧化能力強[2-3]。青梅酒是一種風靡中國、韓國和日本的飲料，因其營養價值高，風味淳樸，香氣宜人，深受廣大消費者的喜愛。大量研究表明，青梅酒品質在發酵過程和保存中都受到各種因素的影響，如酵母、品種、原料地、發酵條件、澄清方法，不同條件澄清方法以及酵母篩選的方法都比較局限性。國內近幾年對青梅酒的研究偏重于產品工藝研發，不斷提高其主要分析檢測、藥用價值和提取鑒定的工藝優化[4]，國外注重于研究青梅酒工藝優化發酵條件以及發酵產品的風味成分[5]。目前已有關于產品工藝條件對青梅酒的品質和成分含量影響的報道，如張超等[6]利用菌株RC212、PRLWVER和DV10研究青梅酒酵母的篩選，嚴紅光等[7]采用明膠、酪蛋白、硅藻土、皂土作為澄清劑研究對青梅酒澄清的影響，多數以復合澄清劑為主。本研究充分利用陽江市陽春地區的特色農產品青梅，釀造出口感獨特的青梅果酒，為提升青梅果酒的品質和穩定性，在單因素試驗基礎上，采用響應面法對青梅酒進行澄清工藝優化的研究，探索最佳的澄清工藝參數，為青梅的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅：陽江市陽春地區果園；青梅酒：本食品加工實驗室發酵。

殼聚糖、檸檬酸：宏大生物科技有限公司；果膠酶、維生素C、纖維素酶：上海源葉生物科技有限公司；RC212酵母、焦亞硫酸鉀：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設備

I3紫外可見分光光度計：濟南海能儀器有限公司；FA224電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司DK-S24恒溫水溶鍋：上海精宏實驗設備有限公司；TGL-18臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；KQ-250E超聲清洗器：昆明市超聲儀器有限公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒的加工工藝流程及操作要點

原料預處理：挑選無病蟲害、無霉變、無落地果、果實飽滿，果肉形體完整，肉質爽口，略帶苦澀、七八分熟的青果，青梅果香味純正，關于成熟的青梅會使果酒變渾濁，且影響果酒的芳香；將挑選好的鮮果用清水細心清果皮上的泥土、雜質，清洗時對青梅進行再次挑選，清洗好的青梅果要用涼白開漂洗2次[8]。

破碎打漿：人工衛生去核，迅速將青梅果肉投入含0.5%維生素C（抗氧化，防褐變）的涼白開水浸泡，按照青梅和水料液比1∶2（g∶mL）加涼白開水，再加入焦亞硫酸鉀（防止氧化，抑制雜菌生長）混合打漿1 min左右得到青梅汁[9]。

酶解處理：添加0.12%的復合酶（果膠酶、纖維素酶比例為1∶1），在室溫條件下協同處理青梅汁8 h，進行酶解[10]。

RC212酵母的活化[11]：酵母粉按照料液比1∶20（g∶mL）溶于2%糖水中，38 ℃恒溫水浴活化30 min后，投入發酵使用。

成分調配：添加白砂糖對青梅汁的糖度和酸度進行調配，使其酸甜適中，使可溶性固形物含量達到18%，控制pH值為3.5條件下發酵，可抑制其他雜菌繁殖。

主發酵：將調配好的青梅汁以1 000 mL的三角瓶為發酵容器，裝液量為70%，酵母菌的接種量為5%，將接好酵母的青梅汁于28 ℃恒溫培養箱中進行主發酵，定時觀察，以確保發酵正常進行。主發酵時間15 d。

后發酵：將過濾好的青梅果酒在20 ℃的恒溫恒濕箱條件下，密閉容器中貯藏（陳釀）1個月。

澄清、過濾：在陳釀好的青梅酒中加入殼聚糖，澄清后再次過濾。

調配：利用白砂糖和碳酸鈣進行青梅果酒的酸甜調配。

貯藏：將調配過濾好的青梅果酒罐裝，密封，在60～70℃熱水殺菌30 min，冷卻取出，即得青梅果酒成品，在10 ℃低溫貯藏[12]。

1.3.2 澄清工藝優化單因素試驗[13-15]

以青梅酒透光率為評價指標，在殼聚糖添加量分別為0、4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L，pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，澄清時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，在澄清溫度為25 ℃條件下，考察殼聚糖添加量、pH值、澄清時間對青梅酒品質的影響。

1.3.3 澄清工藝優化響應面試驗設計

根據單因素試驗的結果，應用響應面法優化澄清工藝，以殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）、pH值（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理，進行3因素3水平的優化設計，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 數據處理與分析

試驗做3次平行測定，結果以均值±標準誤差的形式表示，數據采用Origin Pro 2019b繪圖，響應面法采用Design Expert 10.0.3軟件進行設計和統計分析，SPSS 21.0統計軟件進行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 青梅酒澄清工藝優化單因素試驗

2.1.1 殼聚糖添加量對青梅酒澄清的影響

圖1 殼聚糖添加量對青梅酒透光率的影響Fig.1 Effect of chitosan addition on transmittance of plum wine

由圖1可知，青梅酒的透光率隨著殼聚糖添加量在4～16 g/L范圍內的增加而增大，當殼聚糖添加量為16 g/L時，透光率達到最高值為93.4%，但當殼聚糖添加量＞16 g/L之后，青梅酒透光率反而下降，這是由于殼聚糖是天然的陽離子性絮凝劑，而果酒中含有大量帶負電荷的纖維素、果膠、單寧等微小顆粒，混合后依靠靜電作用，果酒中的微小顆粒會纏繞于有線性分子結構的殼聚糖，使微小顆粒變成大顆粒逐漸沉降，從而使果酒澄清，若濃度過低形成顆粒物少，沉降速度則慢；若濃度過高，易使體系中黏度增大，果酒中懸浮的顆粒物難以沉降[16]。因此，殼聚糖的最佳添加量為16 g/L。

2.1.2 pH值對青梅酒澄清的影響

圖2 pH值對青梅酒透光率的影響Fig.2 Effect of pH on transmittance of plum wine

由圖2可知，pH值在3.0～4.5范圍時，其透光率隨著pH增加而增大，在pH值4.5時透光率達到最大值91.3%，pH值再提高，該酒的透光率下降。因為殼聚糖分子氨基在酸性環境中帶正電荷，與青梅酒中的負電荷物質產生中和作用[17]，產生凝聚作用從而使青梅酒澄清，青梅酒中的pH值的高低還會影響殼聚糖分子中的游離氨基的數量，從而影響殼聚糖對青梅酒膠體物質的絮凝效果。因此，最佳pH值為4.5。

2.1.3 澄清時間對青梅酒澄清的影響

圖3 澄清時間對青梅酒透光率的影響Fig.3 Effect of clarification time on transmittance of plum wine

由圖3可知，青梅酒透光率隨著澄清時間在1～4 d范圍內的延長逐漸增大，在澄清時間第4天透光率達到最高92.1%后，澄清時間超過4 d之后，透光率反而下降。這是由于殼聚糖與青梅酒中的負電荷物質相互作用產生絮凝沉淀物質需要一段時間[18-19]，但放置時間過長，又會有部分絮凝物重新溶于溶液。因此，最佳澄清時間為4 d。

2.2 響應面試驗優化設計與結果分析

2.2.1 響應面模型建立及顯著性分析

在單因素試驗基礎上，以殼聚糖添加量、pH值、澄清時間3個因素進行響應面試驗設計。以殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）及pH（C）為自變量，以透光率（Y）為響應值。響應面優化試驗方案及結果見表2，模型方差分析見表3。

對試驗數據進行回歸擬合，得到自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程，Y=96.18-2.11A+3.45B-4.39C+3.17AB+2.35AC-0.13BC-3.62A2-2.79B2-5.56C2

表2 Box-Behnken試驗設計結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型的P＜0.000 1，達到極顯著，說明響應面法得到的模型可靠；失擬項P值為0.147 7＞0.05，表明失擬項不顯著，沒有失擬現象；A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對結果影響達到極顯著性水平（P＜0.01），BC對結果影響不顯著（P＞0.05），由F值可知影響青梅酒殼聚糖不同條件澄清的因素大小順序為C（pH）＞B（澄清時間）＞A（殼聚糖添加量），在因素交互作用的條件中，AB的交互作用對青梅酒澄清的效果最好，該模型的決定系數R2=0.995 1，模型調整決定系數R2Adj=0.988 7，說明該模型擬合程度高，預測值能較好反映實際值[20]。

2.2.2 各影響因素的交互作用分析

殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）、pH值（C）3各因素之間交互作用的響應面及等高線見圖4。響應面越陡表示交互作用越強，等高線形狀呈橢圓；響應面越平表示交互作用越弱，等高線形狀越圓[21]。由圖4a、圖4b可以看出，響應面的曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形，說明AB、AC之間的交互作用對青梅酒透光率的影響極顯著（P＜0.01），由圖4c可以看出，響應面的曲面坡度較平，等高線較圓，BC的交互作用對青梅酒透光率的影響不顯著（P＞0.05）[22]。

圖4 殼聚糖添加量、澄清時間及pH值交互作用對青梅酒透光率影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between chitosan addition,clarification time and pH on transmittance of plum wine

2.2.3 最優澄清工藝與驗證

經Design-Expert10.0.3優化，采取軟件優化得出在所選試驗因素最優條件為殼聚糖添加量為15.505 0 g/L，澄清時間4.852 9 d，pH值為4.312 5，在此條件下青梅酒的透光率預測值為98.0%。考慮實際操作的可行性，修正最優澄清條件為殼聚糖添加量15.5 g/L，澄清時間5 d，pH值為4.3。在此優化條件下，進行3次平行驗證試驗，青梅酒透光率的均值為97.4%，與預測值接近，說明響應面優化法模型可靠[23]。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗確定了發酵型青梅酒的澄清最佳工藝條件為殼聚糖添加量15.5 g/L、澄清時間5 d、pH值為4.3。在此優化條件下，透光率為97.4%。通過響應面試驗進行澄清工藝優化，得到一種營養價值高、保健效果和口感俱佳的青梅酒，帝伯仕RC212酵母可作為青梅酒發酵工業化的一種參考發酵劑。