凱里腌韭菜根中腐敗細菌的生長特性研究

胡秀虹，韋國蘭，李 培，張廷輝，王 翔，3*

（1.凱里學院 大健康學院，貴州 凱里 556011；2.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556011；3.黔東南民族藥綜合利用工程技術研究中心，貴州 凱里 556011）

腌韭菜根是貴州黔東南的一款本土特色食品。近年來，隨著貴州經濟的發展，旅游業及我國大健康產業的快速興起，腌韭菜根以其豐富的營養成分、獨特的風味及保健功效，逐漸得到推廣和人們的認可。黔東南腌韭菜根的工業化生產是將采集的原生態韭菜根（一種寬葉韭（Allium hookeriThwaites）的肉質根）洗凈晾干后拌以輔料（鹽或糖分）腌制再真空包裝后輻照滅菌或低溫冷藏，食用時可根據當地少數民族人們的口味、喜好加辣椒、白酒、食鹽、油等涼拌也可以當地臘肉炒之[1-3]。然而，韭菜根原料水分含量高又營養豐富，極易因滋生微生物而腐敗，加之環境的影響或不規范的生產操作，袋裝腌韭菜根在貯藏過程中會出現脹袋、變色、軟化、酸敗腐臭等現象，這不僅影響腌韭菜根產品的感官品質，也可能產生潛在的食品安全問題[4-6]。研究表明[7-9]，袋裝食品的腐敗很大程度上與其中的微生物生長代謝密切相關，食品腐敗主要表現在某些微生物生長和代謝時生成有機酸、胺、硫化物、醇、醛、酮等，產生不良氣味，使產品感官改變。不過，研究者也指出，微生物的生長受到如營養物質、溫度、酸堿度、氣體環境、NaCl等多種因素的影響，改變微生物的生長環境，可對其加以控制或利用[10]。因此，研究食品腐敗微生物的生長特性，對指導食品防腐具有重要的意義。

本研究以從脹袋變質的腌韭菜根中分離出的5株腐敗菌：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、萵苣不動桿菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢桿菌（Paenibacillus amylolyticus）、土楊芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為供試菌株，探究其在不同溫度、酸堿度、含氧量、防腐劑等因素下的生長狀況，并確定這幾種微生物耐受高溫的溫度與時間，為解決腌韭菜根腐敗問題提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、萵苣不動桿菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢桿菌（Paenibacillus amylolyticus）、土楊芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）：從脹袋韭菜根中分離篩選，并由凱里學院黔東南民族藥綜合利用工程技術研究中心微生物實驗室分離鑒定；瓊脂粉（生化試劑）、氯化鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素（食品級）：南通奧凱生物技術開發有限公司；蒸餾水：實驗室自制，于121 ℃高壓滅菌20 min可制得無菌水。

牛肉膏蛋白質液體培養基[11]：按《微生物學實驗》中的配方配制，調節pH為7.2～7.5，在液體培養基配方中添加20 g/L的瓊脂粉即得固體培養基，所有培養基均置于121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺：上海蘇凈實業有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫搖床培養振蕩器：上海智誠分析儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱、BGZ-246型電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；BIO-BRI型酶標儀：成都百樂科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

取出保存于冰箱中的菌種，劃線于牛肉膏蛋白胨平板培養基，并于（36±1）℃培養24 h，活化2次。挑取1環菌種加入已滅菌的100 mL牛肉膏蛋白胨的液體培養基中，于（36±1）℃搖床（轉速180 r/min）培養24 h。

1.3.2 不同因素對5種腐敗菌生長的影響

將制備好的各株菌的菌懸液接種于20 mL裝有5 mL肉湯培養基（pH值為7.0）的試管中，使接種后的菌液濃度保持一致，于（36±1）℃搖床（轉速180 r/min）培養24 h后測定菌液的OD600nm值[12]。為了探究各菌株在不同培養溫度、pH值、裝樣量下的生長狀況，在其他培養條件不變的情況下，分別改變單一培養條件，考察不同因素對5種腐敗菌生長的影響。

溫度：保持培養pH值、裝樣量不變，設置培養溫度為4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃，分別在不同溫度下培養，平行實驗3次。

pH值：保持裝樣量、培養溫度不變，用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調節營養肉湯培養基的pH值為4.5、5.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，平行實驗3次。

裝樣量：保持培養pH值、培養溫度不變，設置試管中肉湯培養基裝樣量為2 mL、4 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL，平行實驗3次。

1.3.3 殺菌處理對菌株生長的影響

殺菌溫度：在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃下分別處理20 min，平行實驗3次。

殺菌時間：選用100 ℃，分別處理0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min；平行實驗3次。

1.3.4 防腐劑對菌株生長的影響

選用苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素兩種防腐劑為研究對象，依據國家標準GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[13]設置添加濃度，各防腐劑的添加濃度見表1。將各防腐劑添加到肉湯培養基中，分別接種對數期生長的腐敗菌，使其菌液初始濃度為500 CFU/mL，37 ℃下搖床培養12 h測定腐敗菌的生長情況。另外，以不加防腐劑不接種的肉湯培養基為空白組，以不加防腐劑但接種的為對照組。

表1 單一防腐劑的添加質量濃度Table 1 Mass concentration of single preservatives

1.3.5 數據處理及分析

腐敗菌生長濃度的測定采用比濁法[14-15]，通過酶標儀測定菌液的OD600nm值即測定在波長600 nm處的樣品吸光度值。利用Origin 8.0軟件進行作圖，使用SPSS 25軟件分析及處理數據，顯著性采用Duncan's多重比較法（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 培養溫度對菌株生長的影響

溫度是影響微生物生長與存活的重要因素之一。當微生物處于最適生長溫度時，生長代謝旺盛；而不適宜的溫度則會導致微生物的代謝和形態改變或使微生物的蛋白質凝固變性而導致死亡[16]。不同細菌對培養溫度的要求不一，大多數芽孢桿菌的抗熱能力較強，其最適生長溫度為30～37 ℃[17]。5種腐敗菌菌株分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃條件下培養24 h后，測定的菌液OD600nm值變化結果見表2。

由表2可知，在處理溫度范圍內，隨著溫度的升高，5株腐敗菌的OD600nm值均呈先升高后下降的趨勢，在37 ℃時生長最好，其OD600nm值分別為0.61、0.27、0.43、0.53、0.29，這說明5株腐敗菌的最適生長溫度為37 ℃；在15 ℃和50 ℃時，生長微弱；在4 ℃時，OD600nm值接近零，幾乎不生長。

表2 培養溫度對腐敗菌生長的影響Table 2 Effect of culture temperature on the growth of spoilage bacteria

將4 ℃恒溫培養箱下培養24 h的菌株繼續培養至72 h，測定其OD600nm值，結果表明，5株腐敗菌的OD600nm值在0.143 2～0.315 4之間。由此可見，在較長時間內，4 ℃低溫對5株腐敗菌具有較好的抑制作用。

2.2 pH對菌株生長的影響

細菌的生長需借助于細胞內的各種代謝活動來完成，這些代謝活動大多經不同酶催化的生化反應，反應需要在一定的pH條件下進行[16-17]。

5種腐敗菌菌株分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下培養24 h后的OD600nm值見表3。

表3 pH值對腐敗菌生長的影響Table 3 Effect of pH value on the growth of spoilage bacteria

由表3可知，在處理pH范圍內，隨pH升高，5株腐敗菌的OD600nm值呈先升高后下降的趨勢，巨大芽孢桿菌在pH為6.0時，生長最好，與其他pH處理比差異顯著；土楊芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌在pH為6.5時，生長最好，與其他pH處理比差異顯著；萵苣不動桿菌、解淀粉芽孢桿菌在pH為6.5時，生長最好，與pH=6.0處理比差異不顯著，與其他pH處理比差異顯著；pH在4.5以下或8.0以上時，生長會受到抑制。結果表明，5株腐敗菌具有一定的耐酸性，最適生長pH值為6.0～6.5。本試驗所用腌制韭菜根的pH值為6.28～6.44，十分有利于腐敗微生物的繁殖生長，故生產中需要嚴格控制殺菌pH值，以更好地抑制腐敗菌的生長。

2.3 裝樣量對菌株生長的影響

試管中的裝樣量反映了菌株生長的需氧量。裝樣量（培養液體積）越多，通氧量越少，菌株所獲得的氧氣量則越低[18]。腐敗菌菌株在不同裝樣量（2～14）mL條件下培養24 h后，菌液的OD600nm值，結果見表4。

表4 裝樣量對腐敗菌生長的影響Table 4 Effect of volume of sample loading on the growth of spoilage bacteria

由表4可知，裝樣量為2～8 mL時，5株菌的OD600nm值變化較小，裝樣量為8～14 mL時，5株菌的OD600nm持續下降。根據細菌生長時對氧氣的需求不同，可將其分為專性需氧菌、微需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌4類[16-17]。綜上分析，可判斷該5種腐敗菌均為兼性厭氧菌，即在有氧及氧氣不足的條件下都能生長，有氧時生長更好。這正說明抽真空保存對抑制腐敗微生物有一定輔助作用。

2.4 殺菌處理對菌株生長的影響

2.4.1 殺菌溫度對菌株的影響

腐敗菌菌株經不同高溫處理20 min后，培養24 h的菌液OD600nm值，結果見表5。由表5可知，隨著溫度的上升，菌液OD600nm值降低，其中從90～120 ℃，OD600nm值急劇下降。當殺菌溫度為100 ℃時，OD600nm值均很低，維持在0.056 7～0.148 3之間，說明此溫度下可殺死大部分腐敗菌，不過仍有少數菌株殘留。當溫度升至120 ℃時，OD600nm值接近于零，幾乎全被滅活，由此可知，5株菌耐高溫能力較強。但在實際生產過程中，殺菌溫度過高會影響食品的品質，同時也增加生產成本。因此，可考慮適當降低溫度，延長殺菌時間。

表5 殺菌溫度對腐敗菌生長的影響Table 5 Effect of sterilization temperature on growth of the spoilage bacteria

2.4.2 不同殺菌時間對菌株的影響

在100 ℃下，經不同殺菌時間處理后，培養24 h的菌液OD600nm值，結果見表6。由表6可知，100 ℃殺菌處理必須超過20 min才具有良好的滅菌效果，不過即使殺菌時間達到35 min，也難以將腐敗菌徹底滅活。綜上分析，由于供試菌多為芽孢桿菌，耐熱性較好，故在實際食品生產中，在確保口感、品質及生產成本的前提下，產品不宜采用高溫殺菌，可考慮在較低溫度下保藏或降低酸度或抽真空包裝。

表6 100 ℃高溫處理對腐敗菌生長的影響Table 6 Effect of 100 ℃high temperature treatment on the growth of spoilage bacteria

2.5 防腐劑對菌株生長的影響

2.5.1 苯甲酸鈉的抑菌效果

防腐劑苯甲酸鈉是醬腌菜中使用最多的防腐劑之一。不同質量濃度苯甲酸鈉對5種腐敗菌的抑制效果見表7。

由表7可知，當各腐敗菌的初始濃度約為500 CFU/mL時，在苯甲酸鈉質量濃度為0～0.2 g/kg內，隨著濃度的增加，5株供試菌的OD600nm值明顯下降，通過SPSS25.0中Duncan's多重比較法分析，發現各株腐敗菌在苯甲酸鈉質量濃度為0、0.1 g/kg和0.2 g/kg時的OD600nm值差異顯著（P＜0.05）。繼續升高濃度，各菌的OD600nm值下降緩慢，當苯甲酸鈉質量濃度為0.2g/kg和0.3g/kg時，菌株Bacillustoyonensis與Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差異顯著（P＜0.05），其他菌株不顯著；當苯甲酸鈉質量濃度為0.3 g/kg和0.4 g/kg時，Bacillus toyonensis與Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，添加單一苯甲酸鈉的最佳質量濃度為0.2～0.3 g/kg。當苯甲酸鈉濃度上升至0.5 g/kg時，Bacillus cereus、Acinetobacfer lactucae的OD600nm值趨近于0，Bacillus megaterium、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis的OD600nm值分別為0.080 8、0.090 5、0.142 8。表明苯甲酸鈉（0～0.5 g/L）在一定程度上能有效抑制腐敗細菌的生長。若考慮減少防腐劑用量，增強抑菌效果，后期可考慮與其他防腐劑復配使用[19-21]，復配苯甲酸鈉的最佳添加質量濃度為0.1～0.3 g/kg。

表7 苯甲酸鈉對腐敗菌的抑菌效果Table 7 Antibacterial effect of sodium benzoate on spoilage bacteria

2.5.2 Nisin的抑菌效果

生物防腐劑Nisin自1988年就被公認為一種安全的食品防腐劑，廣泛應用于果蔬、肉制品、香腸和奶酪中，并在制藥、化妝品和保健產品中也開始受到追捧。Nisin對革蘭氏陽性（G+）細菌具有較好的抑制作用，特別是對食品中的一些產芽孢的細菌，如芽孢桿菌[22]。不同質量濃度的Nisin對初始濃度約為500 CFU/mL的5種腐敗菌的抑制效果見表8。

由表8可知，Nisin對腐敗細菌Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的抑制效果顯著，當Nisin的質量濃度為0.2 g/kg和0.3 g/kg時，Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的OD600nm值趨近于0；Nisin對Bacillus megaterium和Paenibacillus amylolyticus的抑制效果較差，其OD600nm值最小為0.019和0.128。通過SPSS25中Duncan's多重比較法分析，當Nisin的質量濃度達0.20 g/kg后，菌株的OD600nm值之間差異不顯著（P＞0.05）。綜上分析，添加單一Nisin的最佳質量濃度為0.20 g/kg，且無論其是作為單一防腐添加劑還是考慮進一步與其他防腐劑復配都將是不錯的選擇。

表8 Nisin對腐敗菌的抑菌效果Table 8 Antibacterial effect of Nisin on spoilage bacteria

3 結論

腌韭菜根中的5株優勢腐敗細菌：Bacillus megaterium、Acinetobacfer lactucae、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis、Bacillus cereus具有較強的耐熱性，其最適生長溫度均為37 ℃，在15 ℃和50 ℃時生長微弱，4 ℃時幾乎不生長。這些腐敗菌具有較好的耐酸性，最適生長pH值為6.0～6.5，且均為兼性厭氧菌。高溫殺菌時，需達100 ℃滅菌20 min以上才能達到較好的滅菌效果。單一防腐劑苯甲酸鈉、Nisin對初始濃度約為500 CFU/mL的腐敗菌具有良好的抑制效果，其添加的最佳質量濃度為0.2～0.3 g/kg。若考慮減少防腐劑的用量，增強抑菌效果，可考慮進一步進行防腐劑復配應用研究。