黃酒中氨基甲酸乙酯的研究進展

楊 佳，李新生，3 *，耿敬章，徐悅菱，劉智強，裴金金，3

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 中國謝村北派黃酒研究院，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點實驗，陜西 漢中 723000）

黃酒是中國最古老的酒種，同啤酒和葡萄酒并稱為世界三大古老酒種，享有“酒中之祖、酒中之王”的美譽。黃酒因其酒體柔和、香氣濃郁、酒味醇厚，加其豐富的營養、獨特的風味，受到廣大消費者的喜愛。近年來，黃酒已被列入我國重點扶植和發展的酒精飲品之一[1]，但黃酒在生產加工、食品質量安全控制方面，與現代化程度較高的啤酒和葡萄酒相比較，還有一定差距。1987年日本有關部門在檢測中國出口到日本的部分紹興黃酒中發現氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的含量超標（＞100 μg/L），并要求我國相關生產企業采取措施進行控制[2]。

氨基甲酸乙酯在一般食品中含量較低，而其在發酵食品（如面包、酸牛奶、乳酪、醬油等）和發酵酒精飲料（如葡萄酒、蘋果酒、啤酒、中國黃酒和日本清酒等）中屬伴隨的副產物[3]，含量相對較高，在食品質量與安全方面屬潛在危害性成分。目前EC的含量已成為國際社會高度關注的發酵類食品安全熱點問題之一，一些國家還規定了不同酒中EC最高限量。圍繞葡萄酒、日本清酒中EC產生的生物學基礎及代謝調控報道也較多，但關于我國傳統黃酒中EC的研究甚少。開展傳統黃酒釀造中EC形成的機制及控制技術研究，對我國傳統黃酒釀造的安全性具有非常重要的理論價值和現實意義[4]。本文對有關黃酒中EC的形成機理、食品安全性評價、檢測方法及控制四個方面的國內外研究現狀進行綜述，旨在為黃酒生產中降低EC的含量，提升黃酒品質提供借鑒和參考。

1 EC的形成機理

EC分子式為NH2COOC2H5，分子質量89.09，CAS#51-79-6，無色無臭，呈結晶或白色粉末狀，易燃，易溶于水、乙醇等，微溶于有機溶劑，不易揮發[5-6]。1971年，LOFROTH G等[7]利用同位素標記實驗表明葡萄酒和啤酒中存在EC。EC是在食品發酵過程中產生的一種發酵副產物，廣泛存在于發酵食品和酒精飲料中，人體攝取EC的主要途徑是飲用酒精飲料[8]。

1.1 氨甲酰化合物與乙醇反應生成EC

1976年，OUGH C S[9]采用氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）在酸乳酪和葡萄酒中檢測到了EC，并證實EC可由氨甲酰化合物與乙醇反應生成。黃酒中發酵代謝產生的氨甲酰化合物主要有：尿素（urea）、瓜氨酸（citrulline）和氨甲酰磷酸（carbamoylphosphate）等[10]。

（1）氨甲酰磷酸-乙醇途徑

釀酒酵母在酒精發酵過程中產生的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、CO2和氨在氨甲酰磷酸合成酶作用下生成氨甲酰磷酸，其與乙醇反應式如下：

（2）尿素-乙醇途徑

OUGH C S等[11]對精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在發酵飲品發酵過程中對EC形成的影響進行了研究，結果表明，由精氨酸分解產生的尿素與乙醇反應生成的EC含量遠多于由氨甲酰磷酸形成的EC含量，成品葡萄酒中絕大部分的EC是由尿素形成的，因此尿素是形成EC的主要前體物質。其反應式如下：

（3）瓜氨酸-乙醇途徑

王霈虹[12]在模擬黃酒溶液中，對尿素、瓜氨酸分別與乙醇經加熱后形成EC的結果進行分析。結論表明，黃酒中的瓜氨酸與尿素處于同一數量級，可與乙醇在加熱條件下也能形成數量可觀的EC。因此瓜氨酸也是黃酒中形成EC的重要前體物質。瓜氨酸與乙醇反應式如下：

H2NCONH（CH2）3CH（NH2）COOH+C2H5OH→NH2COOC2H5+H2N（CH2）3CH（NH）COOH

1.2 黃酒工藝中EC的形成

黃酒具有獨特的生產工藝，如麥曲釀造、高溫煎酒、年份酒勾兌等。雖然采用獨特的生產工藝能釀制出獨特風味的美酒，但同時其過程中條件控制不當，也會伴隨著EC的產生。

（1）麥曲釀造

中國黃酒原料以稻米、麥曲為主，蛋白質含量相對較高，其中高含量的精氨酸分解后產生的尿素與黃酒中乙醇反應生成EC。陳艷[13]在浙江及其附近地區采集了85個黃酒樣品，采用液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法分別對不同酒曲釀造的黃酒中EC含量進行了檢測，結果表明，麥曲釀制的黃酒中EC含量普遍高于紅曲釀制。

（2）煎酒與貯酒

較高的煎酒溫度與適宜的貯酒條件對黃酒的穩定性和香氣形成具有重要作用，但在其過程中會形成更多的EC。加熱可加快EC的形成，溫度每升高10 ℃，EC的形成速度就增加約1倍[14]。陶新功等[15]在實驗中發現，在發酵階段黃酒中EC含量小幅升高，但煎酒后出現大幅回升的現象，隨著黃酒貯存期的延長，EC含量會不斷上升，貯存時間相同，溫度越高，生成的EC越多。羅蘇僅[16]采用GC-MS法對黃酒生產過程中氨基甲酸乙酯含量進行測定結果表明，經煎酒后的黃酒中EC含量是煎酒前的2～4倍；陳釀2年后，EC含量高達113.46 μg/L。

2 EC食品安全性評價

2.1 EC的致癌機理研究

在20世紀40年代，EC以1 g/d的劑量被用作人的催眠劑并作為實驗動物的麻醉劑，但在1943年，NETTLESHIP A等[17]通過動物毒理學實驗證實EC具有致癌性。每周一次重復向小鼠腹腔內注射最小麻醉劑量的EC并對其肺部細胞進行觀察，結果表明，小鼠的肺腫瘤發病率從不到5%增加到了75%以上，腫瘤類型主要是特征性肺腺瘤。大量研究者對EC的致癌機理進行了研究，發現EC在生物體內的代謝途徑主要有3種：其一是超過90%的EC可被分解為乙醇、氨和碳水化合物等；其二是約0.5%的EC被細胞色素P450氧化成脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）加聚物，造成DNA雙鏈破壞，導致癌變；此途徑被普遍認為是EC的主要致癌途徑；其三是0.1%左右的EC被細胞色素（P450）氧化成N-羥基-EC，后者可以誘導Cu2+所調控的DNA損傷從而導致細胞癌變[18]。

2.2 EC食品安全性評價

自1943年EC被發現具有致癌性，世界各國學者又先后在蒸餾酒、醬油和面包等發酵酒精飲料和食品中檢測到了EC，這些研究使各國政府對EC在食品安全領域的關注程度日益增加。1985年，加拿大衛生與防疫部門對酒精飲料中EC含量進行規定：佐餐葡萄酒為30 μg/L，加強葡萄酒為100μg/L，蒸餾酒為150μg/L，烈性酒和水果白蘭地為400μg/L，日本清酒為100 μg/L。美國食品和藥品管理局（food and drug administration，FDA）、美國葡萄酒研究所和美國酒商協會規定：1988年以后生產的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%vol）EC含量不能超過15 μg/L，1989年以后生產的甜葡萄酒（酒精度≥14%vol）EC含量不能超過60 μg/L。2002年，聯合國糧農組織對EC進行重點監控，制定了國際標準：EC含量不得超過20 μg/L[19]。2007年世界衛生組織國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）正式將EC重新分類，由2B組（或可能令人類患癌的物質）改為2A組（可能令人類患癌的物質）[20-21]。

目前，國際上尚無統一的EC限量，各國仍以加拿大EC限量作為主要參照。我國由于發酵食品種類眾多，檢測方法不統一等原因尚未制定酒精飲料和發酵食品中氨基甲酸乙酯限量標準[22]。

3 EC的檢測方法

早在1993年，我國商檢部門采用氣相色譜法建立了出口酒中EC的檢測標準方法[23]。隨著經濟的發展和貿易全球化的進行，如何有效檢驗和控制黃酒中的EC含量，就成為質檢部門關注的問題。近幾年，相繼出現了許多新的檢測EC的方法。

3.1 氣質聯用法

在已報道的各種黃酒中EC的測定方法中，仍以氣質聯用（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）法為主。在氣相色譜法的基礎上，GC-MS法能快速高效地對樣品進行定量和定性分析，更適用于復雜混合物中某組分的鑒定。一般黃酒中的EC檢測采用GC-MS法[24]，其已被國際葡萄與葡萄酒組織（international vine and wine organization，OIV）、美國官方分析化學師協會（association of official analytical chemists，AOAC）和歐盟納入檢測標準方法[25]。采用GC-MS法檢測酒中EC的含量成為了近年來的研究熱點之一。

鮑會梅[26]采用GC-MS法測定黃酒中EC的含量。結果表明，采用GC-MS法檢測出的EC各項指標均符合國標，且操作簡便、檢測快速，該方法適用于黃酒中EC的測定。華穎等[27]建立應用同位素內標-GC-MS法快速測定黃酒和食用酒精中EC的分析方法。該方法定量準確、操作簡便、靈敏度高，適用于黃酒和食用酒精中氨基甲酸乙酯的測定。

目前GC-MS法已被GB 5009.223—2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》采用。

3.2 其他方法

鐘其頂等[28]建立了高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLCFLD）測定黃酒中EC含量的方法，發現此法更為簡單快速、成本較低、易于掌握，適用于生產企業過程監控。王麗娟等[29]建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometric，UPLC-ESI-MS/MS）測定黃酒與葡萄酒中EC含量的方法。該方法樣品處理簡單，前處理過程不使用有機溶劑，測定快速、準確，靈敏度高，適合黃酒中EC的快速檢測和定量分析。LUO L等[30]采用間接競爭酶聯免疫吸附測定法（competitive inhibition enzyme linked immunosorbent assay，Ci-ELISA法）分析中國黃酒。結果表明，通過Ci-ELISA分析實際樣品的結果與GC-MS法的結果相關，該方法具有良好的準確性和可重復性，適用于監測大量樣品中的EC。

4 EC的控制

EC的形成途徑多種多樣，采用單一的方法很難將EC全部清除。國內外關于解決飲料酒中EC問題的研究主要是從減少其來源、工藝條件控制與后續去除等方面去考慮，主要方法如圖1所示。我國學者對黃酒中EC的主要控制途徑研究方面已做了一些基礎性的的工作，其中降低、控制黃酒中EC含量的方法已見報道，并在實際生產中應用。

圖1 氨基甲酸乙酯主要控制途徑示意圖Fig.1 Sketches diagram of the main way to control ethyl carbamate

4.1 構建低產尿素酵母

黃酒中的尿素主要有2個來源：其一是原料、水和輔料會帶入一定量尿素；其二是在發酵過程中由酵母菌代謝精氨酸生成。黃酒中絕大部分的尿素是由釀酒酵母代謝精氨酸產生的，直接參與尿素代謝與轉運的基因有精氨酸酶編碼基因（CAR1）、脲基酰胺酶編碼基因（DUR1，2）、尿素轉運蛋白基因（DUR3），研究表明[31]，釀酒酵母的單個CAR1等位基因表達的精氨酸酶足以降解精氨酸生成大量的尿素，形成數量可觀的EC。

（1）敲除CAR1。在酒精發酵時，酵母胞內的CAR1表達水平較高，精氨酸水解產生大量尿素，進而使酒中EC含量增加。趙然然[32]選育低產尿素的黃酒酵母菌株，通過敲除CAR1的方法改造黃酒酵母，降低其精氨酸酶表達活性，減少酵母分解精氨酸產生的尿素，進而降低酒液中EC含量。方逸群等[33]通過紫外誘變試驗篩選獲得誘變菌株（CAR1缺陷型酵母菌株）。結果表明經過改良菌種發酵獲得黃酒產品與原始菌株相比，發酵產物尿素及EC含量顯著下降。

（2）過表達DUR1，2和DUR3。釀酒酵母在酒精發酵階段時，由于DUR1，2表達受到氮代謝阻遏效應（nitrogen catablite repression，NCR）調控，胞內脲基酰胺酶活性很低，不能及時降解由精氨酸水解所產生的大量尿素，多余尿素被分泌到胞外與乙醇反應生成EC[34]。WU D H等[35]采用代謝工程改造了兩種酵母菌株N85（DUR1，2）和N85（DUR1，2）-c。使用兩種改造菌株發酵的黃酒中EC的濃度比親本菌株發酵的黃酒分別降低49.1%和55.3%。所有工程菌株均顯示出良好的遺傳穩定性，適合商業化以提高中國黃酒的安全性。申超等[36]通過采用融合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術提高DUR3的表達水平，構建了尿素吸收型工業黃酒酵母單倍體工程菌Na-uD。通過實驗發現Na-uD具有“吸收尿素”的能力，能夠有效降低發酵液中尿素及EC的含量，且無外源抗性基因的引入。

4.2 生產工藝過程控制

4.2.1 添加酸性脲酶

通常的尿素降解酶即指脲酶，脲酶分為中性和酸性酶。基于飲料酒的酸性pH，只可添加酸性脲酶。發酵液中的尿素可在外源酸性脲酶的作用下分解為NH3和CO2，進而減少酒中EC的含量[37]。

周建立等[38]構建表達酸性脲酶的乳酸乳球菌，并對重組酸性脲酶對尿素和EC的水解過程進行研究，結果表明重組酸性脲酶對黃酒中尿素具有很好的降解能力（60 mg/L的尿素在25 h內完全被降解）。張傲娜[39]從小鼠糞便、合肥豆制品廠和乳制品廠的污泥中篩選得到一株產酸性脲酶能力較高的菌株，并初步研究該酶對尿素的去除效果。結果表明，該酶能去除75%左右的尿素；經該酶處理的黃酒在煎酒過程中生成的EC含量降低75.7%，表明該酶在黃酒中具有潛在的應用價值。

4.2.2 控制傳統生產條件

（1）縮短浸米時間

王賓等[40]通過模擬黃酒的發酵過程，利用分光光度法和平板計數法對黃酒發酵過程中EC相關前體物質的變化規律進行研究，結果表明，黃酒釀造工藝中的浸米階段會形成瓜氨酸積累，瓜氨酸是EC形成過程中重要的前體物質。因此浸米時間不宜過長，避免黃酒中瓜氨酸的積累。

（2）煎酒與貯存

煎酒與貯存過程均會使黃酒產生數量可觀的EC[16-18]，但其也是黃酒生產中不可或缺的兩個重要工序，所以控制原料及靈活掌握適宜的煎酒條件、貯酒條件和貯酒期，就既能最大程度的保留黃酒營養成分及色、香、味，又能直接減少黃酒中EC的產生量。

（3）EC降解酶

EC降解酶是能直接降解EC的酶，使其降解為氨、CO2和乙醇，此法可直接解決EC問題且不需更換酵母菌種，不改變生產工藝條件和原酒風味特性。劉俊[41]通過基因比較發現，黃酒適用腸桿菌（Enterobactersp.）R-SYB082尿素降解酶是一種酸性脲酶同功酶——脲基乙醇酸酰胺水解酶（ureidoglycolate amidohydrolase，UAH）而非脲酶，該酶能實現黃酒中待去除底物尿素及產物EC的聯合控制，具有很好的應用特性與工業開發前景。

目前為止仍沒有商品化的EC降解酶生產，一是由于己經報道的產生菌酶活都比較低，二是黃酒中的乙醇和低pH環境也對酶的性質有苛刻的要求，而EC降解酶普遍乙醇耐受性及酸耐受性差。

（4）吸附材料

被廣泛開發和應用的吸附性材料是合成樹脂，其具有多孔性立體結構的小顆粒，在整個顆粒內部及外部具有表面活性，其與物質間的相互作用能達到物質的分離、凈化等目的。

王翼瑋等[42]通過篩選得到能夠有效吸附黃酒中EC的大孔結構吸附樹脂。研究結果表明，該樹脂具有良好的吸附性能和再生能力，對EC吸附去除率可達70%以上，且對黃酒的主要理化指標沒有顯著影響。高雅[43]優選出吸附黃酒中EC效果較好且對其風味物質影響較低的兩種樹脂材料DM301和DA-201，將二者進行復配后可進一步減少風味物質的損失。另得出結論，在最適工藝條件下黃酒的EC去除率可達76.81%。

5 展望

綜上所述，黃酒在釀制及貯存過程產生的EC的含量的控制，目前的研究主要集中在黃酒中EC的形成機理、食品安全性評價、檢測方法及控制四個方面。EC的研究已取得一系列成果，但如何在不影響黃酒品質的條件下，高效經濟地控制并去除EC，并能大規模應用到實際生產中的技術體系尚未建立。雖然在發酵液中直接添加酸性脲酶控制EC含量的方法已建立，但酸性脲酶只能專一地分解EC合成前體物質尿素，不能分解EC或對其分解率極低，酸性脲酶作用的局限性，影響了其在酒類行業中使用；且由于諸多原因目前為止仍沒有商品化的EC降解酶生產。已發現許多新型樹脂吸附材料可去除EC，進一步提高去除率，并實現在生產中應用，還需要后續更深入的研究。