拉曼光譜聯合ICP-AES 法鑒定鹿茸真偽

馮 源高麗君韓 笑苑廣信孫晶波?

（1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.北華大學醫學技術學院，吉林 吉林 132013）

鹿茸是指梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，是名貴的藥材［1］。《本草綱目》 記載鹿茸、鹿角、鹿角膠、鹿角霜、鹿鞭、鹿血、鹿腦、鹿尾、鹿腎、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿頭肉、鹿骨、鹿齒、鹿髓等都可入藥，有極高的藥用價值和保健功能，能夠預防和治療多種疾病。而鹿的初生幼角—鹿茸更是被視作“寶中之寶”［2］。鹿茸中的性激素對女性的更年期綜合征有預防和治療作用，其中的生物堿基，包括尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷等具有抑制單胺氧化酶的抗衰老作用，尤其有研究表明其中含有的胰島素樣生長因子（IGF-1），對糖尿病及其并發癥有特殊的療效［3］。鹿茸中也含有豐富的微量元素，如Ca、Co、Mg、P、Mn、Cu 等微量元素，這些微量元素不僅參與骨骼和軟組織的構成，也是細胞中許多維持生命的化合物的重要成分，并能夠促進人體對鹿茸中有效成份的吸收［4］。然而市場上常有采用茸角無藥效動物，如水鹿、白臀鹿、白唇皮等茸角偽充鹿茸銷售［5］。為更好地鑒別鹿茸樣品的真偽，一種快速有效的鑒別方法尤為重要。

拉曼光譜（SERS），是一種散射光譜。無論樣品是固體、液體、膠體、粉末、還是軟膏都可以快速表征其化學成分和結構［6］。相比于其他常規分析方法，具有樣品制備簡單，操作方便，不受水份干擾，樣品可回收，綠色環保等優點［7］。近年來SERS 也多被用于食品、藥品、生物制品的鑒定中。其具有檢測限低、吸附選擇性良好，可以增強振動信號的優點，因此在中藥鑒定中具有重要意義［4］。

電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES），利用樣品受到激發后發射出光譜的波長及強度，對樣品進行定性及定量分析。目前多用ICP 作為激發光源，ICP-AES 方法具有檢出限低、精確度高、選擇性好、線性范圍寬、分析速度快、測定范圍廣等特點，能夠同時測定多種元素，從而被廣泛應用于中藥分析［8］。

鹿茸中有效成分復雜，依靠單一組分無法進行真偽鑒別［2］。SERS 法可以直接測得鹿茸樣品，全面表征其中多種成分的共同特征［9］；而ICP-AES 可同時檢測樣品中多種微量元素，借以對不同樣品進行分析、鑒別［7］。鑒于上述分析，課題組采用上述2 種方法相結合對鹿茸進行定性鑒定，以期建立快速、穩定、有效的真偽鑒別方法［10］。

1 方法

1.1 材料 Renishaw inVia 顯微拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司）；VISTA-MPX 電感耦合等離子體原子發射光譜儀（美國瓦瑞安公司）；MAS 微波消解儀（上海新儀微波化學科技有限公司）。硝酸、濃鹽酸均為優級純、溴化鉀、硝酸銀、檸檬酸三鈉，均購自吉林市欣利化學試劑有限公司。標準離子貯備液：國家標準溶液（1 000 μg/mL），購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院。

實驗所用20 例正品鹿茸樣品為梅花鹿茸和馬鹿茸樣品（北京同仁堂新城藥店、吉林省長春市雙陽區鹿鄉、吉林省吉林市匯豐參茸行、吉林省吉林市龍潭區鹿廠）；35 例偽品鹿茸（國藥控股國大藥店、安國萬達、史有開中醫診所、恒瑞白云店、吉林省長春市雙陽區鹿鄉、珠海生來堂藥店、吉林省吉林市匯豐參茸行）。所有樣品均經吉林市食品藥品檢定所金英蘭主任藥師進行真偽鑒定。

1.2 測試條件

1.2.1 SERS 條件 光譜測量范圍0～3 200 cm-1；采用波長為633 nm 激光作為光源；總功率20 mA；物鏡50 倍；激發光源的強度均為10%；掃描時間約1 min；平均掃描3次［11］。最佳檢測波長見表1。

1.2.2 ICP-AES 條件功率 1 000 W；等離子 氣15 mL/min；輔助氣體積流量200 kPa；霧化氣、自動積分及接口吹掃均開啟；采用多色器高吹。

表1 各元素最佳檢測波長

1.3 處理方法

1.3.1 樣品處理 鹿茸粉末，取鹿茸切片，冷凍干燥48 h，取出，研磨，過100 目篩，分別放入1.5 mL EP 管中，編號，于4 ℃條下保存備用。

1.3.2 銀膠溶液配制 參考Lee 等［12］的方法，以檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀納米粒子。取硝酸銀溶液100 mL 放于磁力攪拌器上攪拌（1 000 r/min）加熱至90 ℃，再將2.6 mL 檸檬酸三鈉溶液（0.039 mol/L）逐滴加入，保持90 ℃恒 溫1 h，直到溶 液呈黃綠色，避光保存（現配現用）。

1.3.3 SERS 法 取適量樣品置于載玻片上，滴加“1.3.2”項下新制銀膠溶液，待其成糊狀后，用載玻片壓平并進行拉曼掃描檢測。

1.3.4 ICP-AES 方法 取樣品0.2 g 于消化管中，依次加入濃硝酸6 mL、濃鹽酸2 mL，浸泡24 h，將消化管放入微波消解儀器中，消解功率1 000 W，升溫8 min 至110 ℃保持6 min，再升溫至140 ℃維持6 min，升溫至180 ℃維持30 min，消解完成后將消化管直接放入加熱套中，150 ℃條件下趕酸，待酸剩余1 mL 左右取出，將剩余液體轉入25 mL 量瓶中，用去離子水定容后直接進樣、檢測。

1.4 數據處理

1.4.1 SERS 數據預處理 為排除其他因素對SERS 的影響，應用Origin8.0 軟件對SERS 進行平滑處理以消除噪聲，得到SERS 信號，進而在0～3 500 cm-1范圍內對每條譜線進行歸一化處理，便于比較不同光譜的形狀及光譜強度之間的差異，最后得出真、偽鹿茸樣品的平均表面增強拉曼光譜。

1.4.2 統計學方法 采用SPSS 16.0 對兩獨立樣本的強度均值進行獨立樣本t檢驗分析；建立Fisher 識別函數。

1.4.3 ICP-AES 選取鹿茸中所含的5 種人體必需的常量元素，Ca、K、Mg、P、Na；人體必需的微量元素，Fe、Zn、Mn、Sr、Cr；一般無機元素，Ba 為代表，進行ICPAES 檢測［13］。運用Graphpad prism 軟件對數據進行處理，建立元素含有量折線圖，以便于對鹿茸樣品中元素含有量進行快速分析。

2 結果與討論

2.1 拉曼光譜及分析

2.1.1 條件及方法選擇 鹿茸樣品的常規拉曼光譜以及表面增強拉曼光譜，見圖1，鹿茸粉末直接測試拉曼光譜（1A）沒有明顯的特征吸收峰，只有一個熒光包，這應該是由于中藥材中成分含有量復雜、自身熒光較強導致的。然而經過測試，滴加了新制銀膠溶液的鹿茸樣品，則出現了多個吸收峰，選取多個樣品點，驗證得出了SERS 圖，該圖非常穩定，特征拉曼吸收峰的位置固定，因此可用來鑒別鹿茸的真偽。

圖1 鹿茸粉末樣品SERS 圖

2.1.2 結果 掃描后運用Origin8.0 軟件得正品和偽品鹿茸2 組樣品面積歸一化后的SERS 光譜，見圖2，選取0～3 500 cm-1的區間范圍作為研究對象，鹿茸的生物分子歸屬見表2［14-21］。真、偽鹿茸的平均SERS 光譜的形態和譜峰大體相 似。主要的 譜峰位 于155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587、2 918 cm-1位移處，但譜峰強度存在差異（P＜0.05），進一步采用獨立樣本t檢驗進行組間兩兩比較，結果 顯示在155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS強度強于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統計學意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的 SERS 強度強于正品（P＜0.05），差異有統計學意義。真偽2 組鹿茸樣品的SERS 光譜強度比較，見表3。

表2 鹿茸SERS 譜峰歸屬

2.1.3 Fisher 識別函數建立 分別選取5 個經上述拉曼檢測已知真偽的鹿茸正品及偽品樣品歸一化的SERS 吸收峰強度值，運用SPSS 16.0 建立判別鹿茸樣品真偽的Fisher識別函數，通過計算得出正品及偽品的判別函數如下，（F1 代表正品鹿茸樣品組，F2 代表偽品鹿茸樣品組，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分別為鹿茸155、227、723、959、999、1 094、1 322 cm-1位移所對應的拉曼強度）。

圖2 正品與偽品鹿茸歸一化后平均SERS 光譜

表3 真偽2 組鹿茸樣品的SERS 光譜強度比較

若F2＞F1，鹿茸為偽品；F2＜F1，鹿茸為正品。

2.1.4Fisher識別函數驗證 表4 表明，55 個鹿茸樣品中，20 個鹿茸樣品有19 個準確識別，準確率為95%；35個偽劣鹿茸中有34 個準確識別，準確率為97%。由此可見Fisher 函數對已知真偽的鹿茸具有很好的識別效果，這一方法可用于未知鹿茸樣品鑒別。

表4 識別函數對已知樣本的識別效果

2.2 微量元素含有量 將上述53 種來源不同的真、偽鹿茸片進行ICP-AES 檢測，檢測結果見表5～6。

表5 不同來源正品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（n＝5，mg/kg）

本研究檢測了鹿茸樣品中Ba、Ca、Cr、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、Sr、Zn 等11 種元素的含有量，見圖3～4，其中Na 元素的含有量在20 例正品鹿茸中的平均含有量1 000≤Na ≤1 500 mg/kg，而偽品鹿茸中含有量為Na ＜1 000 mg/kg；正品鹿茸中K 元素含有量均大于等于500 mg/kg，偽品鹿茸K＜500 mg/kg。通過計算元素含有量的平均值，見表5～6，發現正品鹿茸中Ca、Mg、Na、P、Zn 的含有量平均高于偽品鹿茸，而Fe、Sr 的平均含有量偽品鹿茸高于正品鹿茸，但差距不是很大。

圖3 真偽鹿茸樣品中Na 元素平均含有量走勢圖

表6 不同來源偽品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（mg/kg）

圖4 真偽鹿茸樣品中K 元素平均含有量走勢圖

3 結論

中藥成分含有量復雜，各成分含有量比例也不同，因此其光譜也具有差異［22］，本研究利用表面增強SERS 法、微量元素檢測法對55 種鹿茸樣品進行分析。運用SERS 法可以通過155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS 強度強于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統計學意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的SERS 強度強于正品（P＜0.05），差異有統計學意義，進行鹿茸的真偽鑒別且通過SERS 檢測所得拉曼強度建立的Fisher 識別函數，對已知鹿茸的鑒別正確率達96%，因此可以通過Fisher 識別函數結合拉曼光譜法實現對鹿茸的準確識別。

微量元素檢測法可以通過分析人體必需常量元素Na、K 元素在鹿茸中的含有量對真偽鹿茸進行鑒別，正品鹿茸中Na 元素含有量應1 000 ≤Na ≤1 500 mg/kg、K 元素含有量也應大于等于500 mg/kg［23］。

因此，表面增強拉曼光譜法聯合應用Fisher 識別函數以及微量元素檢測法更適用于對鹿茸樣品的鑒別，該方法準確、有效。根據研究結果建立鹿茸真偽的鑒別方法，利用鹿茸對照品建立其表面增強拉曼光譜庫，以期為鹿茸的研究提供依據。