當歸HPLC 指紋圖譜建立及化學計量學評價

汪英俊嚴 輝?黃勝良汪國強楊美權彭國平

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210013；2.江蘇融昱藥業有限公司，江蘇 淮安 223001；3.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023；4.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650223）

當歸藥材來源于傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。始載于《神農本草經》，列為中品，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功效［1］，是中醫臨床常用的補血藥和婦科要藥，素有“十方九歸”之稱，主產于甘肅、青海、云南、四川等省，以甘肅岷縣所產為道地，稱“岷當歸”。當歸中主要含有揮發油、有機酸、多糖等化學成分，現代藥理研究發現，當歸及其主要化學成分具有廣泛的生物活性，對造血、循環、神經系統等均有藥理作用［2-3］。近年來，我國中藥工業增長迅速，對中藥資源可持續供應產生了巨大的壓力。2017 年，當歸為我國中藥材十大出口品種之一，出口量在2 723.98 噸，出口額2 539.53 萬美元，出口金額占比為2.23%［4］。目前中藥材人工栽培是解決供需矛盾的主要手段，而基于化學農業的中藥種植模式正使中藥材安全和質量面臨前所未有的挑戰，與此同時，中藥材種植區域的不斷擴大和盲目引種，也造成中藥材質量問題日益突出［5］。

由于中藥藥效物質基礎具有多組分、多靶點的特點，導致中藥質量標準的研究較為復雜［6］。當前中藥質量控制的方法有色譜法、一測多評法、近紅外光譜技術、多元統計分析法、DNA 條形碼分子鑒定法等，部分技術方法還處于發展階段，尚未大規模推廣應用，而HPLC 法在中藥質量控制中已被廣泛使用，具有操作簡單、快速、高效、高靈敏度的特點［7］。其基于整體性和模糊性特點的中藥指紋圖譜技術是符合中藥特點的質量控制模式之一，化學計量學的引入進而將中藥復雜的多成分鑒別轉化為對數據的解析，達到定性與定量研究的目的［8］。有關指紋圖譜結合化學計量學的當歸質量研究已有報道［9-10］，本研究在建立當歸HPLC 指紋圖譜的基礎上，通過對照品比對、相似度評價、主成分分析和聚類分析等識別技術對樣品進行研究，同時對其近緣種加以區分，以期為當歸的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 Alliance 高效液相色譜系統（美國Waters 公司，含四元泵溶劑系統、在線脫氣機、自動進樣器、PDA 檢測器，Empower 3 工作站）；賽多利斯BSA323SCW 型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；EPED 超純水系統（南京易普達易科技發展有限公司）；KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；D2012 高速臺式離心機（大龍興創實驗儀器北京有限公司）；1000 型睿核高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿有限公司）。

1.2 試劑 對照品綠原酸（批號lw18022809）、阿魏酸（批號lw18042309）、Z-藁本內酯（批號lw18010501）、正丁基苯酞（批號lw18012301）、洋川芎內酯Ⅰ（批號lw18041806）、洋川芎內酯H（批號lw18042506）、阿魏酸松柏酯（批號 lw180315016）、丁烯基苯酞（批 號lw18014801）、洋川芎內酯A（批號lw17111714）均購自南京良緯生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；超純水（Milli-Q 超純水系統制備）；無水甲酸（上海麥克林生化試劑有限公司）；冰醋酸等試劑為分析純。

1.3 樣品 當歸藥材來源全國不同產區，信息見表1。當歸近緣種藥材信息見表2，朝鮮當歸樣品由長春中醫藥大學張輝教授贈與，遼藁本樣品由遼寧省農科院經作所孫文松研究員贈與，上述樣品均經南京中醫藥大學嚴輝副教授鑒定為正品，標本保存于南京中醫藥大學中藥標本館。

表1 當歸樣品信息

表2 當歸近緣種樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Symmetryshield C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5%的醋酸水（B），梯度洗脫（0～25 min，5%～45% A；25～35 min，45%～55% A；35～45 min，55% A；45～55 min，55%～95% A；55～60 min，95% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 稱取適量綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內酯、丁烯基苯酞對照品，精密稱定，加乙腈制成質量濃度分別為0.15、0.23、0.19、0.12、0.32、0.73、0.28、1.25、0.45 mg/mL 的對照品貯備液。分別精密吸取貯備液1 mL 置于10 mL 量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻。

2.3 供試品溶液制備 取當歸藥材粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入3%甲酸甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，補足減失質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號S1）10 μL，在“2.1”項色譜條件下，連續進樣6 次，記錄色譜圖。以Z-藁本內酯為參照峰，得各共有峰相對保留時間RSD 為0.08%～0.45%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.06%～0.73%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一當歸樣品5 份（編號S1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，以Z-藁本內酯為參照峰，得各共有峰相對保留時間RSD 為0.07%～0.15%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.05%～1.79%。表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（編號S1），在“2.1”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、16、24 h 進樣10 μL，記錄色譜圖。以Z-藁本內酯為參照峰，得各共有峰相對保留時間RSD 為0.05%～0.15%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.35%～1.25%。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 指紋圖譜建立 精密稱定35 批不同產地的當歸樣品，每份約0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，得色譜圖。將其導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）進行分析，以樣品S1 的色譜圖為參照，以中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，經多點校正、自動匹配后生成指紋圖譜的共有模式見圖1。

圖1 35 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.5.2 共有模式建立及色譜峰定位 根據35 批當歸樣品指紋圖譜的檢測結果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）進行數據匹配，生成對照圖譜。在對照圖譜上標定24 個共有峰。通過與對照品色譜圖中保留時間比對，指認8 個共有峰，其中3 號峰為綠原酸、6 號峰為阿魏酸峰、7 號峰為洋川芎內酯Ⅰ峰、8 號峰為洋川芎內酯H峰、13 號峰為阿魏酸松柏酯峰、14 號峰為正丁基苯酞峰、17 號峰為Z-藁本內酯峰、18 號峰丁烯基苯酞峰，其中以峰面積大且分離度較好的17 號峰為參照峰（S），得各共有峰相對保留時間RSD 為0.20%～0.64%，相對峰面積RSD為23.3%～64.5%，表明不同產地不同批次樣品含有量存在差異，見圖2。

2.5.3 相似度評價 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），對35 批樣品指紋圖譜數據進行分析，計算得35 批樣品和對照指紋圖譜之間的相似度，結果見表3，35 批樣品相似度為0.824～0.989，表明當歸的化學成分組成較為相似，各批次當歸中化學成分含有量存在一定差異，S23 和S24 號樣品相似度較低，可能與藥材產地、生長年限、栽培及采收加工貯藏等因素有關，需進一步分析。

2.5.4 近緣種指紋圖譜 在“2.1”項色譜條件下，得11批當歸近緣屬藥材樣品HPLC 圖譜，將當歸藥材樣品HPLC對照指紋圖譜和11 批近緣屬藥材樣品HPLC 圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），結果見圖3。得到7 批近緣屬藥材樣品相似度，其中白芷（0.160）、朝鮮當歸（0.253）、川芎（0.772）、獨活（0.203）、遼藁本（0.759）、歐當歸（0.706）、野生當歸（0.852）、防風（0.046）、前胡（0.039）、日本當歸（0.115）。

圖2 各成分HPLC 色譜圖

表3 35 批樣品相似度

當歸在我國使用歷史悠久，易混品、偽品較多，來源復雜，分布廣泛，有些系同屬植物，藥性相近；有些系其他科屬植物，藥性全然不同，混用摻偽給用藥安全帶來極大隱患。根據相似度并結合色譜圖發現白芷、朝鮮當歸、獨活、防風、前胡與當歸整體峰形差別較大，采用HPLC指紋圖譜可以從化學成分上較好地進行區別；而歐當歸、川芎、藁本與當歸的指紋圖譜相似度較高，共有峰較多，表明他們之間的化學成分相似，結果見圖4。但川芎在35～36 min 時出現一較高峰，經對照指認為洋川芎內酯A，為川芎藥材特征峰，而當歸中幾乎不含有洋川芎內酯A，可作為二者的特征性鑒別成分。從圖譜對比中可以看出，川芎和藁本中均存在特征峰，可與當歸進行區別；歐當歸的化學成分與我國當歸相近，兩者有較高的相似度，但二者在Z-藁本內酯含有量差異明顯，研究表明歐當歸藁本內酯的質量分數為中國當歸的25.23%，并指出中、日、韓，歐洲當歸原植物的來源不同，藁本內酯等活性成分有顯著差異，其功效也會不同［11］，因此不宜替代、混淆用藥。

圖3 11 批當歸近緣種藥材HPLC 指紋圖譜

圖4 當歸、川芎、藁本及歐當歸圖譜比較

2.6 聚類分析 將35 批樣品的24 個共有峰的峰面積作為變量，導入到SPSS 22.0 軟件，得到35×24 階原始數據矩陣，采用組間聯結，利用平均歐式距離法作為樣品間距離計算方法進行系統聚類分析，結果見圖4。聚類結果表明在聚類閾值底層，藥材產地較近，隨著閾值增加，產地相同或地理距離較近的樣品被聚在一起，35 批樣品可分為三大類，其中S23 和S24 單獨聚為一類；來自云南（S11～S15）的聚為一類；甘肅與青海的聚為一類，其中來自岷縣西寨鎮當歸標準化原料基地的藥材（S1～S10）也基本聚在一起，表明不同產地的當歸藥材在質量上存在一定差異，當歸藥材具有明顯的地域區分性。聚類結果與相似度分析結果一致，可用于當歸藥材質量一致性評價，見圖5。

2.7 主成分及因子分析 運用SPSS 22.0 及Simca 13.0 軟件對35 批樣品24 個共有峰的峰面積數據進行主成分分析，計算主成分特征值、累積貢獻率，結果抽樣適合性檢驗系數KMO 值=0.821 ＞0.7，且巴特利特球形檢驗顯著性P=0＜0.05，因此數據適合做因子分析。見表4。

主成分的特征值及貢獻率是選擇主成分的依據。以特征值大于1 為提取標準，表1 可知前5 種主成分的方差累積貢獻率為85.786%，表明提取的5 種主成分可以代表原始色譜峰峰面積的大部分信息，能較好的反映當歸藥材指紋圖譜特征。

圖5 35 批樣品聚類樹狀圖

表4 主成分初始特征值和貢獻率

表5 旋轉后因子載荷矩陣

旋轉后共有峰因子負荷矩陣，見表5。結果表明，第一主成分包含的各因子其載荷系數綜合體現峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰12 和峰18 對第一主成分的影響；峰6、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰19、峰20、峰23 在第二主成分中有明顯正負荷值；第三主成分反映了峰21 和峰24 的信息；第四主成分反映峰4 和峰11 的信息；第五主成分反映了峰3 的信息。可見、第一主成分和第二主成分集中反映了當歸藥材中藥效指標成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎內酯1）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本內酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析變量上權重值較大，其中峰6 為阿魏酸峰，為當歸藥材的法定指標性成分。以PC1 和PC2 建立坐標系進行投影，得35 批樣品主成分得分矩陣圖，見圖6，可直觀顯示樣品間的差異。表明，S11～S15 投影聚在一起，S23、S24 號當歸藥材與其他產地藥材投影點相距較遠，結果與聚類分析結果相一致。

圖6 35 批樣品主成分得分矩陣圖

35 批樣品的性狀及特征圖譜進行綜合評價，發現化學成分較為一致，但各成分的含有量存在差異。由相似度及聚類分析結果可知，云南的樣品聚為一大類，青海的樣品與甘肅的樣品聚為一大類，分析云南樣品的指紋圖譜共有峰峰面積時，發現6 號、13 號與17 號峰的峰面積較其他產區大，表明3 種成分在云歸中含有量較高。

在主成分分析中，第一主成分和第二主成分集中反映了當歸藥材中的藥效指標成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎內酯Ⅰ）、8（洋川芎內酯H）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本內酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析變量上權重值較大，其中峰6 為阿魏酸、峰17 為藁本內酯，為主要指標性成分，其中藁本內酯在當歸含有量較高，且具有松弛平滑肌的作用，是抗膽堿和乙酰膽堿的良藥?！断愀壑兴幉臉藴省?中收載了當歸藥材中藁本內酯的含有量測定項目，因此，建議當歸藥材質量標準中應當加入關于藁本內酯含有量的規定，以便更為全面地控制當歸質量。同時本研究后期需要增加樣本量及產地的代表性，進一步研究不同產區當歸的質量差異。

3 討論

3.1 指紋圖譜建立 對當歸藥材的提取條件、方式及檢測波長等進行了考察。同時對乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸水和乙腈-0.5%醋酸水等流動相進行考察，發現乙腈-0.5%醋酸水作流動相進行梯度洗脫時各色譜峰分離度較好。實驗前期曾分別比較25% 甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇和3%甲酸甲醇4 種溶劑對阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯H、洋川芎內酯Ⅰ等成分提取效率的影響；比較不同提取方式（回流與超聲）對色譜峰的影響，結果發現不同的提取方式對13 號峰（阿魏酸松柏酯）影響明顯，加熱回流提取此峰完全消失，可見阿魏酸松柏酯遇熱不穩定，極易分解，與文獻報道一致，阿魏酸松柏酯受熱遇光極易分解成阿魏酸和松柏醇［12］。因此《中國藥典》 中用回流提取的方式測定阿魏酸含有量可能不真實；對提取時間的考察，分別比較超聲提取30、45、60 min 對色譜圖的影響，30 min 提取效率最佳。通過條件優化，最終建立了分離度好、色譜峰較全面的當歸HPLC 指紋圖譜，共確認24 個共有峰，通過對照品比對，結合紫外吸收光譜特征，指認出8 個共有峰。

3.2 有效成分含有量差異 云南產當歸中指標性成分阿魏酸含有量較高，阿魏酸是當歸酚酸類代表性成分，也是當歸的中藥活性成分之一，其鈉鹽在心腦血管疾病方面具有廣泛的效用。張金渝等［13］比較不同產地云當歸中阿魏酸的含有量發現，大理鶴慶馬廠產當歸阿魏酸含有量最高可達1.459 mg/g；孫紅梅等［14］也發現云南省沾益縣當歸雖然外觀不具有優勢，但是其指標成分含有量較高。云當歸多栽培于云南西北部高寒山區，主要分布于大理、麗江、迪慶等地，低緯度高海拔及優越的氣候條件成就了云歸的品質，產地環境氣候與藥材品質的相關性還有待于進一步探討。近年來，昆明、曲靖等地當歸栽培面積增長較快，其產區生態環境、栽培方式、加工方法，以及藥材外觀性狀、品質與傳統云歸均有一定區別，有待進一步評價。

中藥材是中醫藥的源頭，中藥質量的提升必須對藥材質量進行嚴格把控。近年來由于市場需求劇增及國家政策的影響，發展中藥材栽培已成為很多地區脫貧致富及產業轉型升級的選擇，不同產地的藥效物質有所差異，用藥的安全性、有效性尚需深入研究。借鑒中藥質量標志物研究的思維模式和方法，著眼于中藥生產全過程的物質基礎特有、差異、動態變化和質量的傳遞性、溯源性，有利于建立中藥全程質量控制及質量溯源體系，以期為質控提供新的思路和方法［15］，有助于中藥質量控制體系的逐步完善。