清宣止咳顆粒對咳嗽大鼠抗炎和免疫調節的影響

喬 燕，朱瀟瀟，吳建元，吳 娟，張興德

（南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023）

咳嗽是比較常見的臨床癥狀，多由呼吸系統疾病引起，是學齡前期及學齡期兒童比較常見的疾病。咳嗽的主要發病機制與細胞免疫失衡、氣道慢性炎癥的形成有關［1］。目前，臨床上針對咳嗽只能對癥處理，小劑量激素、抗生素、鎮咳藥是比較常用的藥物［2］。但以上藥物的維持時間較為短暫，容易造成病情反復，而且西藥的不良反應也時有報道。中醫藥注重標本兼治，在治療咳嗽方面積累了大量的經驗。清宣止咳顆粒是小兒外感風寒咳嗽的一種常用藥，處方來源于我國第一批國家級名老中醫張珍玉教授多年臨床行之有效的經驗方，已經被大量文獻報道在改善咳嗽臨床癥狀方面有較好的療效［3-4］。但目前有關清宣止咳顆粒藥物作用機制的研究較少。選取清潔級Wistar 大鼠為研究對象，通過清宣止咳顆粒來干預咳嗽模型大鼠，探討清宣止咳顆粒的抗炎和免疫作用。

1 材料

1.1 動物 50 只清潔級Wistar 大鼠（生產許可證號SCXK（滬）2018-0007），健康雄性，體質量180～220 g，于研究院動物飼養室飼養，清潔Ⅱ級，室溫18～22 ℃，相對濕度50%。

1.2 試劑與藥物 清宣止咳顆粒（江蘇蘇中藥業集團股份有限公司，國藥準字Z1999066，10 g/袋，5 袋/盒），由桑葉、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陳皮、枳殼、紫菀、甘草九味中藥組成。10% 水合氯醛（美國Sigma 公司，貨號47335-U MSDS）；LPS（美國Sigma 公司，貨號L2630 MSDS）；辣椒素（美國Sigma 公司，貨號M1022 MSDS）；10%中性福爾馬林（美國Sigma 公司，貨號47083-U MSDS）；IL-4 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E04 635 r）；IL-8 試劑盒（美國Kamiya Biomedical 公司，貨號KT-60204）；TNF-α 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E11987r）；IgE 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E07984r）；LTC-4 試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司，貨號YM-2978B）；IFN-γ 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E04579r）。

2 方法

2.1 造模 將所有大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為空白組、模型組、清宣止咳顆粒低、中、高劑量組。清宣止咳顆粒組建立咳嗽模型，參照相關文獻中的造模方案［5］。將大鼠放入1 m3的染毒箱內進行香煙煙霧暴露，以鋸屑末50 g 加10 只香煙點燃煙熏，1 次/d，熏煙40 min/次，連續12 d。大鼠在此期間自由飲水進食。每日觀察記錄大鼠的一般狀況，包括體質量、呼吸、進食水量、肛溫、精神狀況、毛發等。第13、16、19 天采用10%水合氯醛麻醉后，將0.4 mg/mL 的LPS 溶液滴入大鼠的鼻腔，滴入量以10 μL/g 計算。第14、15、17、18、20 天將大鼠置于透明密閉容器中霧化吸入的辣椒素溶液（1×10-4mol/L）3 min進行激發，觀察2 min，1 次/d。觀察各組大鼠的狀態。當大鼠出現呼吸加深、加快、急促、咳嗽，鼻部濕潤，行動呆滯或俯伏不動等表現時提示造模成功。于造模第19 d 開始灌胃干預。

2.2 分組、給藥 造模成功后清宣止咳顆粒組采用清宣止咳顆粒藥物灌胃，清宣止咳顆粒低、中、高劑量組給藥劑量分別為清宣止咳顆粒0.75、1.5、3.0 g/kg 以原藥計算［6］，灌藥體積為10 mL/kg；模型組給予同等體積的生理鹽水灌胃，灌胃1 次/d，連續給藥15 d。

2.3 HE 染色 將所取得的大鼠的鼻竇組織經10%中性福爾馬林浸泡后采用石蠟包埋，制作切片，厚度為4 μm。烤干后對相應的切片編號，光學顯微鏡下觀察大體組織病變和炎癥細胞浸潤情況。

2.4 血液指標的檢測 取大鼠的腹主動脈血，離心機離心分離血清后進行指標的檢測。炎性因子指標包括白IL-4、IL-8、TNF-α，免疫調節因子指標包括IgE、LTC-4、IFN-γ，以上指標均采用ELISA 法測定。嚴格按照試劑盒的操作說明進行。以上實驗過程的指標檢測均由南京醫科大學實驗動物中心獲得。

2.5 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件，計量資料采用（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用方差分析，以P≤0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般狀態 造模前各組大鼠的體質量均衡，進食飲水、呼吸、肛溫等基本一致，無顯著性差異。空白組大鼠毛發有光澤、呼吸平穩、行動靈活、糞便正常。模型組和清宣止咳顆粒組的大鼠造模后毛發不榮，眼睛無神，煩躁不安、呼吸急促、咳嗽喘息、消瘦、活動減少。模型組小鼠體質量增長緩慢，清宣止咳顆粒組隨著干預時間的延長，咳嗽、咳喘癥狀逐漸減輕，飲食、飲水、行為活動趨于正常。實驗期間模型組大鼠死亡2 只，清宣止咳顆粒低劑量組死亡1 只大鼠。

3.2 大鼠鼻竇黏膜組織HE 染色 空白組大鼠鼻竇黏膜上皮完整，管腔未擴大，無明顯增生和壞死，黏膜下層未見炎性細胞浸潤。模型組的鼻竇黏膜上皮細胞變性嚴重（滲出、水腫、出血），黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤，纖毛變性壞死脫落。清宣止咳顆粒組的大鼠鼻竇黏膜上皮細胞增生，部分纖毛變性，黏膜下層可見少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻竇黏膜組織HE 染色（×40）

3.3 大鼠的炎癥因子水平 與空白組比較，模型組IL-4、IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，清宣止咳顆粒高劑量組IL-4、IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 清宣止咳顆粒對大鼠的炎癥因子的影響（）

表1 清宣止咳顆粒對大鼠的炎癥因子的影響（）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.4 大鼠免疫調節水平 與空白組比較，模型組IgE、LTC-4 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，清宣止咳顆粒高劑量組IgE、LTC-4 水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 清宣止咳顆粒對大鼠的免疫調節指標的影響（）

表2 清宣止咳顆粒對大鼠的免疫調節指標的影響（）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，# P＜0.05。

4 討論

咳嗽常急性起病，反復發作，治療起來具有一定的難度。目前多數學者都認為咳嗽與多種炎癥細胞、炎性介質、細胞因子共同參與的氣道高反應性有關［7］。臨床上對咳嗽多以對癥治療為主，臨床應避免繼發細菌感染。但西藥治療具有反復發作及突發性表現，應用中成藥最佳。中成藥制劑具有多靶點，能夠調理患兒的機體、提高全面免疫力，減少反復發作。清宣止咳顆粒是一種純中藥制劑，由桑葉、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陳皮、枳殼、紫菀、甘草九味中藥組成，獨具用藥風格，藥均溫潤、不寒不熱，藥性溫和，以輕宣為主，不傷稚陰及脾胃。該中成藥可宣肺止咳、祛風解痙，對小兒常見的咳嗽咳痰、鼻塞流涕、咽痛咽癢以及發熱等都有較好的療效。清宣止咳顆粒具有鎮咳、祛痰、抗炎的藥理作用［3］，能夠養血護肺，在不引起2 次損傷的情況下，修復現有損傷。

本研究通過清宣止咳顆粒干預咳嗽大鼠模型，探討作用機制。結果顯示，清宣止咳顆粒能夠顯著減輕咳嗽大鼠的鼻竇黏膜上皮的病理表現，鼻竇黏膜上皮細胞無明顯的壞死，伴少量的淋巴細胞浸潤。對大鼠腹主動脈炎癥因子和免疫調節因子檢測發現，清宣止咳顆粒高劑量組大鼠的IL-4、IL-8 及TNF-α 均顯著低于模型組（P＜0.05）。IL-4、IL-8 及TNF-α 屬于比較常見的炎性因子，在氣道炎癥反應中發揮著重要的作用。其中IL-4 可影響T 細胞分化，啟動和維持炎癥反應，促進IgE 的合成與分泌，嗜酸細胞的浸潤和激活［8］。IL-8 可趨化和激活中性粒細胞、T 淋巴細胞，釋放炎性介質，加重氣道炎癥，導致氣道平滑肌肥大增，引起氣道黏膜水腫。TNF-α 是巨噬細胞分泌的肽類炎性介質，可刺激蛋白溶解酶、氧自由基的大量釋放，誘導各種細胞因子的產生，使中性粒細胞黏附和聚集，改變氣道產生炎性，增高氣道反應性［9］。模型組的IL-4、IL-8 及TNFα 較空白組顯著上升，表明以上因子與氣道炎癥的形成關系及氣道高反應有關。本研究結果還顯示，清宣止咳顆粒高劑量組的IgE、LTC-4 低于模型組，IFN-γ 高于模型組（P＜0.05）。IgE 是一種免疫球蛋白，可參與肥大細胞和嗜酸性粒細胞的免疫功能，屬于過敏反應的介導物質。LTC-4是體內白三烯的主要組成部分，參與氣道高炎癥反應的多個環節，可導致炎癥細胞在氣道內大量聚集［10］。IFN-γ 是一種保護性免疫調節因子，能夠增加宿主的防御能力［11］。模型組IgE、LTC-4 顯著升高，IFN-γ 顯著降低，而清宣止咳顆粒則改善了這種狀態，這說明清宣止咳顆粒可通過調節三者的血清含有量，達到調節集體免疫功能紊亂，抑制或阻斷氣道慢性炎癥反應的目的。這可能是清宣止咳顆粒治療咳嗽的重要作用機制。

綜上所述，清宣止咳顆粒能夠抑制咳嗽大鼠炎癥細胞細胞因子釋放，減輕炎癥反應，調節免疫異常，這可能是其治療咳嗽的作用機制。