丹參提取物對鉛中毒小鼠腎氧化應激的保護作用

曹春芽龔 明?仇成鳳王 安關 嵐劉新民

（1.湖南醫藥學院，湖南 懷化 418000；2.懷化市第一人民醫院，湖南 懷化 418000；3.中南大學，湖南長沙 410208；4.侗醫藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000）

鉛污染已成為世界當今普遍存在現象之一，隨著國家工業化水平不斷提高，推動經濟迅猛發展的同時，也加大了鉛污染的范圍，增加慢性鉛中毒的可能性。鉛對神經細胞有強親和力，尤其對兒童的神經系統及智力發育有嚴重的毒害作用［1］。世界衛生組織把鉛確認為對兒童影響最嚴重的有毒化學物質，能影響兒童生長發育，降低免疫力。慢性鉛中毒對神經系統、血液系統、心血管系統、骨骼系統等可產生終身性的傷害，鉛中毒臨床表現常會出現頭痛、頭暈、失眠，甚至煩躁、昏迷、貧血、肝腎損害等癥狀。目前治療的方法可分為西醫治療與中醫治療。西醫臨床上主要是通過螯合鉛，促進鉛的排泄。其分為兩類，一類是以依地酸二鈉鈣為代表藥物的羧基螯合鉛；另一類是以二巰丁二酸鈉為代表藥的巰基螯合鉛。但是螯合劑治療易造成人體基本元素的缺失，易引起電解質的紊亂，其不良反應限制了廣泛應用。中醫認為鉛中毒的病機為肝失疏泄、肝膽郁滯、氣化失常，可運用解毒清熱、化瘀、疏肝利濕藥物治療［2］。張喜蓮等［3］應用疏肝利膽法可降低血鉛含有量，避免必需微量元素鈣、鋅的流失。中藥處方多組分、多部位、多靶點、多環節的整體治療特點，適合于癥狀體征復雜的慢性鉛中毒的治療，因而從天然產物中尋找預防、治療慢性鉛中毒的安全藥物具有重要的意義。

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止血、清心除煩、涼血消癰等功效［4］，是丹桃金活血方中的主要藥味之一?，F代藥理研究表明丹參可改善微循環，對中樞神經有調節作用，可減輕鉛中毒煩躁、多動癥狀，有利鉛中毒患者神經衰弱、失眠多夢癥狀的調節［5］。因此，本研究探討丹參提取物對鉛中毒小鼠腎臟氧化應激保護的作用機制，以期為丹參提取物治療慢性鉛中毒提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 雄性昆明小鼠60 只，體質量20～25 g，購自南方醫科大學動物中心，生產許可證號 SCXK（粵）2017-0015。

1.2 試藥 丹參購自龍源大藥房，經湖南醫藥學院王鼎老師鑒定為正品。丹參提取物本實驗室自制［6］，即取丹參飲片適量，加9 倍量的60%乙醇提取1.5 h，濃縮成生藥材質量濃度分別為2、4、6 g/mL。醋酸鉛對照溶液（國家標準物質研究中心）；二巰基丁二酸（DMSA，美國Sigma 公司）；血清尿素氮（BUN，批號20170812）、血 清肌酐（CR，批號20170520）、丙二醛（MDA，批號20170514）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號20170815）、超氧化物歧化酶（SOD，批號20170720）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號15596-026），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 造模、分組 取60 只清潔級雄性昆明小鼠，隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥組、丹參提取物低、中、高劑量組。適應性喂養1 周后，稱定質量。除正常對照組外，每組小鼠均按體質量進行腹腔注射醋酸鉛20 mg/kg，正常對照組注射相同劑量的生理鹽水，每隔1 天注射1 次，自由采食、飲水，連續20 d。造模完成后對小鼠灌胃給藥，正常對照組、模型組每天灌胃給予純化水，陽性藥組按體質量灌胃DMSA 混懸液70 mg/kg，丹參提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組按質量分別灌胃丹參提取物（20、40、60 g/kg），1 次/d，連續給藥10 d。

2.2 樣本采集與制備 給藥10 d 后，禁食不禁水24 h 后，眼眶取血，處死小鼠后迅速摘取小鼠的左右腎，生理鹽水洗凈，吸干水分，稱定質量。取左腎組織用10%福爾馬林固定，用于組織病理學觀察，右腎低溫冷凍保存。

2.3 測定腎臟系數 處死前測定小鼠體質量，處死后迅速摘取腎臟，洗凈、吸干水分、稱定腎臟質量，腎臟系數=（腎臟質量/小鼠體質量）×100%。

2.4 測定血清生化指標 眼眶取血，離心，取上清液，采用全自動生化學檢測儀（HTTACHI）測定小鼠BUN、CR水平。

2.5 觀察腎組織病理學變化 10%福爾馬林固定腎組織，酒精脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯溶液脫蠟，HE 染色，脫水，封片，光學鏡觀察組織病理學變化。

2.6 測定氧化應激指標 嚴格按照各試劑盒的說明書測定腎臟組織中的GSH-Px、SOD 及MDA 水平。

2.7 檢測Bcl-2、BaxmRNA 表達 按TRIzol 試劑盒說明書提取腎組織勻漿的總mRNA，采用qRT-PCR 檢測腎臟組織中Bcl-2、BaxmRNA 表達，所用引物見表1。

表1 引物序列

2.8 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析。數據以（）表示，多組間采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 丹參提取物對體重及腎臟系數的影響 如表2 所示，與正常對照組比較，鉛處理的小鼠的生長受到影響。與模型組比較，丹參提取物組（低、中、高劑量）與陽性藥組小鼠的體質量增加（P＜0.05），其腎臟系數減小（P＜0.05）。

3.2 丹參提取物對BUN、Cr 水平的影響 如圖1 所示，與對照組比較，模型組小鼠 BUN、Cr 的水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組降低小鼠BUN、Cr 水平（P＜0.05），且具有劑量依賴性。

表2 丹參提取物對小鼠體質量及腎臟系數的影響（，n＝10）

表2 丹參提取物對小鼠體質量及腎臟系數的影響（，n＝10）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖1 丹參提取物對小鼠BUN、Cr 水平的影響（n＝10）

3.3 丹參提取物對組織切片病理學的影響 如圖2 所示，正常對照組腎組織結構完整、無組織病理改變，模型組則有模糊的組織結構、腎小球、腎小管上皮細胞萎縮。丹參提取物組（低、中、高劑量）不同程度改善了腎組織的病理學變化，其中丹參提取物高劑量組的腎組織損傷改善程度最高。

圖2 光鏡下觀察小鼠腎組織病理學改變（HE，× 400）

3.4 丹參提取物對SOD、GSH-Px、DMA 水平的影響 如圖3 所示，與正常對照組比較，鉛處理后小鼠SOD、GSHPx 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組SOD、GSH-Px 水平升高（P＜0.05），MDA水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖3 丹參提取物對SOD、GSH-Px、DMA 水平的影響（n＝10）

3.5 丹參提取物對Bax、Bcl-2 mRNA 表達的影響 如圖4所示。與正常對照組比較，模型組Bcl-2 mRNA 表達降低，BaxmRNA 的表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組Bcl-2 mRNA 的表達增加，BaxmRNA 表達降低（P＜0.05）。

4 討論

腎臟是對鉛敏感的靶器官。鉛在腎臟積累嚴重影響身體發育，造成一系列生理、生化指標的變化，影響中樞和外周神經系統、心血管系統、生殖系統、免疫系統的功能［7-8］。鉛處理的小鼠體質量顯著減輕，組織病理學變化明顯，BUN、Cr 的水平顯著升高，表明醋酸鉛致小鼠中毒模型已成功建立。

BUN、Cr 分別為含氮有機物和蛋白代謝的終產物，作為腎小球濾過功能的診斷和過篩指標，當腎小球濾過功能減低時，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。現代藥理研究表明天然的抗氧化劑能保護鉛中毒引起的腎細胞的損傷，改善腎功能［2，9］。組織病理學顯示，改善腎組織結構損傷程度與丹參提取物劑量呈正比。與模型組相比，丹參提取物各組小鼠的BUN、Cr 的水平顯著降低。這可能是由于丹參提取物中含有以丹酚酸為代表的大量酚酸類化合物，而大量的酚羥基結構的物質具有良好的抗氧化作用［10］，從而起到修復腎組織結構損傷作用。

圖4 丹參提取物對小鼠Bcl-2 及Bax mRNA 水平的影響（n＝10）

研究表明氧化應激在鉛誘導細胞損傷中扮演重要角色［11］。GSH-Px 可以保護細胞膜的結構［12］，SOD 是機體內天然存在的超氧自由基因子［13］，MDA 作為脂質過氧化的分解產物［14］，這3 個指標的水平變化反映機體內氧化程度，可作為細胞損傷的重要指標。與模型組對比，陽性藥組、丹參提取物組的GSH-Px 和SOD 水平顯著提高；MDA 水平顯著降低。這表明丹參提取物能夠消除活性氧自由基，抑制脂質過氧化，增強抗氧化防御系統，改善腎組織損傷。

Bax 和Bcl-2 作為重要的細胞蛋白來調節細胞凋亡，同時也是2 種對立的蛋白質，其之間的比值暗示了細胞發展的方向。Bax 過度表達促進細胞凋亡，而Bcl-2 的作用與其相反［15-16］。正常對照組BaxmRNA 表達顯著低于模型組；與模型組對比，丹參提取物各組BaxmRNA 表達均顯著性降低，Bcl-2 mRNA 表達的變化趨勢與之相反。這表明丹參提取物可通過調節Bax與Bcl-2 mRNA 的表達，抑制鉛誘導的細胞凋亡。

綜上所述，本研究闡明丹參提取物對鉛中毒小鼠腎氧化應激保護的作用機制。通過加強抗氧化防御、抑制腎細胞凋亡、改善腎組織損傷，這可能與丹參提取物中酚酸類結構物質抗氧化與抑制細胞凋亡的功能相關，這為丹參減輕鉛中毒煩躁、多動癥狀，改善鉛中毒患者神經衰弱、失眠多夢癥狀的調節作用提供理論依據。我國的鉛污染范圍廣，以丹參為原料，研制出平緩排鉛、副作用小的保健食品或藥品，預防鉛中毒，特別是防止兒童鉛中毒，具有重要意義。