利肺片對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影響

陳 霞，劉 丹，段娟娟，李晉生，張曉笛，何麗娟，黃 倩，張瀚濤，顧海鷗

［1.北京中研同仁堂醫藥研發有限公司，北京 100079；2.北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，北京 100079；3.中國北京同仁堂（集團） 有限責任公司，北京 100079］

流行病學調查發現，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在我國總人群發病率為8.6%，其中40 歲以上人群中發病率高達13.7%［1］，已成為我國嚴重威脅人民群眾健康的重大慢性疾病。因此，探索有效的治療藥物及方案已成為研究的焦點。COPD 的發病機制是多因素參與的結果，至今尚未完全闡明。西醫在控制COPD 急性發作及感染方面，目前優勢突出，但治療上仍局限于對癥處理。中醫藥在治療該病有其獨特的辨證優勢，擅長多靶點多層次整體調節，具有治則治法豐富，療效穩定，不良反應少等獨特優勢。所以研究挖掘治療該病確切有效的中成藥已經成為COPD 防治研究的重要策略。利肺片具有驅癆補肺、鎮咳化痰之功效，用于肺癆咳嗽、咯痰、咯血、氣虛哮喘、慢性支氣管炎等。有文獻報道和臨床實際應用過程中發現利肺片對COPD 具有一定的治療作用。因此本研究開展了相應的藥效學研究，以期進一步明確藥物治療COPD 的效應機制。

1 材料

1.1 動物 Wistar 大鼠，SPF 級，雄性，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。生產許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 試劑與藥物 利肺片（北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號15122182）。氨茶堿（石藥集團歐意藥業有限公司，批號040150304）；固本咳喘片（精華制藥集團股份有限公司，批號23151102）；脂多糖（美國Sigma 公司，批號064M4125V）；SOD（批號20160902）、MDA（批號20160901）、NO 試劑盒（批號20160820）購自南京建成生物工程研究所；MMP-9 ELISA 試劑盒（美國Cusabio 公司，批號C07031593）。

1.3 儀器 AniRes 動物肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司）；Epoch2 酶標儀（美國BioTek 公司）。ADVIA2120i血液分析儀（德國Siemens 公司）。自制煙熏箱（60 cm×60 cm×70 cm），由有機玻璃制成。

2 方法

2.1 造模、分組、給藥 Wistar 大鼠，雄性，105 只，適應性喂養9 d，隨機分為空白組、模型組、氨茶堿組（0.06 g/kg）、固本咳喘片組（0.36 g/kg）及利肺片高、中、低劑量組（0.3、0.15、0.075 g/kg）。造模方法參照文獻［2］略加改動，造模組大鼠在第1 天和第14 天用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，快速向氣管內注入1 mg/mL的脂多糖溶液，每只0.2 mL，然后將大鼠固定板豎立旋轉，左右搖晃約30 次，使脂多糖溶液能夠均勻分布于兩肺，空白組大鼠注入生理鹽水。煙熏（插管日不煙熏），實驗第2～13 天及第15～60 天將造模組大鼠放入自制煙熏箱內給予煙熏，每次15 只大鼠，10 支香煙/次，2 次/d，30 min/次。空白組大鼠不煙熏。在模型復制過程中，有20只造模大鼠死亡，模型制備的成功率為77.8%。各給藥組分別灌胃給予相應的藥物，1 次/d，連續給藥4 周；空白組和模型組灌胃給予同體積蒸餾水。

2.2 測定大鼠肺功能 末次給藥后用AniRes 動物肺功能分析系統檢測大鼠肺功能（FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF）。

2.3 檢測血清NO、MDA、SOD 水平 腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒說明書測定血清中NO、MDA、SOD水平。

2.4 檢測炎癥細胞分類計數 對大鼠左側肺葉用冰生理鹽水2 mL 進行灌洗，用ADVIA2120i 血液分析儀進行炎癥細胞分類計數。

2.5 檢測MMP-9 水平 采用ELISA 法。取出右肺葉迅速放入液氮中，用以測定肺組織中MMP-9 水平。

2.6 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計學軟件進行分析，數據以（）表示，進行方差齊性檢驗。方差齊采用方差分析；方差不齊采用非參數檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般生長狀態 空白組大鼠身體毛發白有光澤，無煩躁不安，呼吸平穩均勻，鼻頭濕潤沒有喘促，食量及飲水穩定，活動正常，排便正常，體質量增長迅速。其余各組大鼠在整個造模過程中，動物表現由開始的煩躁不安轉為精神萎靡不振。隨著造模過程的推移，動物身體毛發逐漸枯槁、發黃、無光澤，呼吸急促、喘息、腹式呼吸加重，鼻頭日漸發紺、分泌物較多，飲水增加，活動減少，喜拱背蜷縮，喜扎堆聚集，體質量明顯減輕。給藥3 周后，給藥組較模型組體質量明顯增加，癥狀明顯改善。見表1。

表1 利肺片對COPD 模型大鼠體質量的影響（）

表1 利肺片對COPD 模型大鼠體質量的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.01。

3.2 大鼠肺功能 與空白組比較，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中劑量組升高FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF（P＜0.05，P＜0.01）；利肺片低劑量組升高MMF、PEF（P＜0.05）。提示利肺片能較好地改善COPD 肺功能。見表2。

表2 利肺片對COPD 模型大鼠肺功能的影響（）

表2 利肺片對COPD 模型大鼠肺功能的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平 與空白組比較，模型組大鼠血清SOD、NO 水平降低（P＜0.01），血清MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組可 升高大 鼠血清SOD、NO 水平（P＜0.05，P＜0.01），利肺片高、中劑量組可降低大鼠血清MDA 水平（P＜0.05）。見表3。

表3 利肺片對COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影響（）

表3 利肺片對COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.4 大鼠肺灌洗液中炎癥細胞 與空白組比較，模型組大鼠肺灌洗液中WBC 總數、淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞數量升高（P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組大鼠肺臟灌洗液中WBC 總數、淋巴細胞、巨噬細胞數量降低（P＜0.01）。利肺片可改善COPD 模型大鼠肺臟組織炎性細胞浸潤，具有一定的抗炎作用。見表4。

表4 利肺片對COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎癥細胞分類計數的影響（）

表4 利肺片對COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎癥細胞分類計數的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.5 大鼠肺組織中MMP-9 水平 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-9 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組可降低大鼠肺組織MMP-9 水平（P＜0.01）。由此可見利肺片具有明顯緩解COPD 大鼠蛋白酶/抗蛋白酶失衡的作用。見表5。

表5 利肺片對COPD 大鼠肺組織中MMP-9 水平的影響（）

表5 利肺片對COPD 大鼠肺組織中MMP-9 水平的影響（）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

4 討論

COPD 是以持續的氣流受限為主要特征，并呈進行性發展的一種常見的慢性呼吸道疾病，最終發展為肺心病和呼吸衰竭慢性疾病。COPD 臨床表現為慢性咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難、喘息和胸悶等癥狀，在中醫學中其被歸屬于“喘證”“氣短”“痰飲”“咳嗽”“哮證”“肺脹”等病范疇［3］。其最根本的原因是機體虛弱、抵抗力低下，尤其是肺脾腎三臟之虛，成為COPD 反復發作的核心。利肺片由百部、百合、五味子、枇杷葉、白及、牡蠣、甘草、冬蟲夏草、蛤蚧粉配伍而成。本方為治肺腎兩虛、氣失攝納之咳嗽、咯血、哮喘等癥的常用有效成藥。方中五味子酸溫而潤、上斂肺氣、下滋腎陰，有止咳平喘之效，冬蟲夏草既補腎陽，又益肺陰，且可止血化痰，蛤蚧補肺腎，定喘止嗽，百合甘而微寒，清肺潤肺而止咳，諸藥補肺斂氣、益精血而止血共為主藥；枇杷葉、百部化痰止咳、祛癆殺蟲為輔藥；白及收斂止血，牡蠣收斂固澀為佐藥；甘草補益肺腎、調和諸藥為使。全方攻補兼施、扶正驅邪，具有補肺益腎、止咳化痰之功［4］。文獻報道利肺片對COPD 急性發作期和穩定期患者均有一定的治療作用［5］。80 例COPD 急性發作住院患者口服利肺片輔助治療后，能明顯降低CAT 評分改善患者臨床癥狀、提高動脈血氧分壓和肺功能，具有治療急性發作期COPD 的作用［6］。辛大永［7］觀察利肺片治療慢性阻塞性肺疾病穩定期的臨床觀察80 例，治療28 d 后利肺片能明顯改善COPD 穩定期患者的咳喘癥狀和肺功能，提高生活質量。同時，利肺片有明顯的鎮咳、平喘、祛痰的作用［8］。由此推測利肺片對COPD有一定的治療作用。

肺功能檢查是診斷COPD 的金指標，也是判斷氣流受限的主要客觀指標，1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比值百分數（FEV1/FVC%）是評價氣流受限和COPD 嚴重程度的最敏感指標，因為大鼠的呼吸頻率比人快，所以本研究選擇FEV0.3/FVC% 來代表FEV1/FVC%。用力最大呼氣流速（PEF）能夠反映氣道有無阻塞。最大呼氣中期流速（MMF）主要取決于用力肺活量非用力部分，該指標反應小氣道阻塞情況。研究發現COPD 模型大鼠FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 顯著降低，表明該模型大鼠氣道阻力明顯增高，氣流受限，存在阻塞性通氣障礙，而利肺片可顯著升高COPD 模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、PEF、MMF，使其氣流受限得到改善，具有顯著改善肺功能的作用。

無論在COPD 的發病起始還是在COPD 的整個病程中，炎癥一直被認為是最重要的機制。有害顆粒物（包括煙霧、細菌等微生物）進入肺內激活體內的炎癥反應系統，從而釋放出多種炎性介質、蛋白酶類（如MMP-9 等）和大量氧自由基和氧化產物（如MDA 等），造成體內蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化/抗氧化失衡，使肺細胞外基質過多破壞降解，彈性纖維斷裂，促進肺組織破壞以及氣道的重塑導致氣流受限［9］，從而促進COPD 的發生和發展［10-11］。本研究中COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎性細胞明顯增加，而利肺片能顯著降低COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中白細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的數量，具有改善肺組織炎性細胞浸潤的作用。MDA 是脂質過氧化代表產物之一，可反映氧化應激的嚴重程度。SOD 是機體內重要的抗氧化劑，其氧化活性代表了體內抗氧化能力的高低［11-12］。COPD 模型大鼠血清中MDA 水平明顯升高，SOD 活性和NO 水平顯著降低，體內氧化/抗氧化明顯失衡，利肺片可顯著升高COPD模型大鼠血清SOD 活性、NO 水平，并下調模型大鼠血清中MDA 水平，具有明顯的抗氧化作用，對抗COPD 模型大鼠體內的氧化/抗氧化失衡。MMP-9 是降解細胞外基質的主要酶類，可增加氣道高反應性和組織損傷，促進氣道重塑，導致氣流阻塞［13］，利肺片能明顯降低COPD 模型大鼠肺組織中MMP-9 含有量，從而對抗蛋白酶/抗蛋白酶失衡，發揮治療的作用。

由此可見，利肺片具有較好的改善COPD 肺功能的主要藥效學作用，其中抗炎、抗氧化、下調肺組織中MMP-9含量可能是藥物治療COPD 效應機制的關鍵環節。其作用機制有待于進一步研究。