白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠NF-κB 信號通路的影響

章 波檀燕君麥婉婷郭富雙梁秋云黃秋潔葉 勇?

（1.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；3.南寧市第一人民醫院藥劑科，廣西 南寧 530001）

慢性肝損傷所導致的肝臟纖維化是一個可逆過程，其受多種機制調節。肝纖維化產生的中心環節為肝星狀細胞活化，活化的肝星狀細胞大量分泌細胞外基質，使得細胞外基質生成與降解平衡紊亂，導致大量細胞外基質沉積，從而產生肝纖維化［1］。白背葉根Mallotus apelta（lour.）Muell.-Arg.root 為大戟科植物白背葉的干燥根，民間常用其治療肝炎。有研究［2-3］表明白背葉根對四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化有較好的治療作用，但對其作用機制研究尚不明確。本實驗通過對NF-κB 信號通路的研究，在分子水平探討其抗肝纖維化的機制，以期為白背葉根藥用價值的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物 白背葉根采于廣西壯族自治區賀州市，經廣西中醫藥大學傅鵬副教授鑒定為大戟科植物白背葉的根；秋水仙堿（批號20170718，）購自廣東彼迪藥業有限公司。

1.2 動物 SPF 級雄性SD 大鼠，體質量170～200 g，購于廣西醫科大學動物實驗中心。實驗動物生產許可證SCXK（桂）2014-0002；實驗動 物使用 許可證 SYXK（桂）2014-0003。

1.3 試劑 PC-Ⅲ（批 號20171010）、Col-Ⅳ（批號20171102）、HA（批號20170910）、LN（批號20171010）、MMP-9（批號20171210）購自上海源葉生物科技公司；IL-1β（批號R180102-007 a）、IL-6（批號R180102-003a）試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；TRIZOL 試劑（批號180401）、逆轉錄試劑 盒（批 號00621709）購自美 國Thermo Fisher 公司；qPCR 試劑盒（批號154047520）購自德國QIAGEN 公 司；NF-κBp65（批 號00057379）、IκBα（批號00024903）兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；山羊抗兔-IgG（批號9300014001）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.4 儀器 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）；紫外分光光度計（日本津島公司）；連續光譜掃描式酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；MP-300 V 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 白背葉根水提取物制備 白背葉根陰干后粉碎至粗粉，稱取100 g，1 000 mL 雙蒸水煎煮2 h，紗布過濾，得提取液。藥渣以上述方法煎煮2 次，合并濾液，離心去渣。將濾液旋轉蒸發濃縮，干燥至膏狀，以雙蒸水配成5 g/mL（生藥量）溶液，儲于4 ℃冰箱備用。

2.2 造模、分組、給藥 將SD 雄性大鼠隨機分為對照組，模型組，秋水仙堿組（0.2 mg/kg），白背葉根水提取物高、中、低劑量組（生藥5、2.5、1.25 g/kg），每組12 只。除對照組灌胃給予橄欖油外，其余各組大鼠給予體積分數50% CCl4的橄欖油（1 mL/kg）造模，每周灌胃給藥2 次，每5 d 根據實際體質量調整CCl4劑量；第8 周，對照組、模型組給予等量生理鹽水，給藥組按照給藥劑量灌胃給藥，1 次/d，連續給藥8 周，同時除對照組灌胃給予橄欖油外，其余各組大鼠給予體積分數50%CCl4的橄欖油（1 mL/kg）造模。

2.3 血清及肝臟標本的采集 大鼠處死前一晚禁食不禁水，采血前稱定各組大鼠體質量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無抗凝真空采血管腹主動脈采血，常溫下3 000 r/min離心血液，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存，用以后續測定MMP-9、IL-1β、IL-6 水平。各組大鼠肝臟以生理鹽水清洗后稱定質量，切取肝左葉邊緣2 cm 大小，置于10%福爾馬林溶液固定，用于HE 染色；余肝臟置于-80 ℃冰箱保存，用于PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平的測定及qRT-PCR 和Western blot 實驗。

2.4 觀察組織肝纖維化程度 采用HE 染色。將經福爾馬林溶液固定后的肝臟組織常規脫水、石蠟包埋、切片，進行HE 染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟的肝纖維化程度。

2.5 血清生化指標及炎癥因子檢測 采用全自動生化檢測儀檢測血清中ALT、AST、ALP、ALB 及TP 水平，采用ELISA 法測定血清中MMP-9 及IL-1β、IL-6 水平。

2.6 肝纖維化指標測定 采用ELISA 法測定肝組織勻漿中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.7Col-Ⅰ、TNF-αmRNA 檢測 TRIZOL 法提取總RNA，逆轉錄后進行qRT-PCR，結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表1，由TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司設計合成。

表1 引物序列

2.8 檢測肝組織中NF-κB p65、IκBα 蛋白 采用Western blot 法。提取各組肝組織的總蛋白，微量核酸檢測儀進行蛋白定量。取100 μL 蛋白樣品至EP 管中，加入5×SDS 上樣緩沖液25 μL，100 ℃煮10 min 進行蛋白質變性，冰上冷卻，置于-20 ℃冰箱保存。電泳采用10% SDS-PAGE 凝膠，蛋白質轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶于4 ℃封閉1 h，分別用NF-κB p65 抗體（1∶1 000），IκBα（1∶1 000），βactin 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然后加入山羊抗兔-Ig G 抗體（1∶30 000）避光孵育1 h。將每個樣本所測得的NF-κB p65、IκBα 蛋白灰度值，分別與β-actin 蛋白的灰度值相比，計算灰度比值。

2.9 統計學分析 以SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料均以（）表示，方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較應用LSD 法；方差不齊則應用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠生存狀況及肝組織病理觀察 實驗結束前，除對照組外其余各組大鼠均有死亡。其中，模型組死亡4 只，秋水仙堿組死亡1 只，白背葉根水提取物高劑量組死亡1只，白背葉根水提取物中劑量組死亡1 只，白背葉根水提取物低劑量組死亡3 只。HE 染色顯示，對照組大鼠肝小葉結構完整，肝索排列整齊，肝細胞未見腫脹及其他異常，未見淋巴細胞浸潤及纖維沉積。模型組大鼠肝臟假小葉形成明顯，肝索排列紊亂，出現淋巴細胞浸潤，肝細胞出現腫脹、氣球樣變等病態改變，部分肝細胞發生脂肪變性，肝臟匯管區沉積大量膠原纖維。秋水仙堿組及白背葉根水提取物組肝組織損傷明顯改善，白背葉根水提取物低劑量組肝組織損傷較模型組有所減輕。見圖1。

3.2 大鼠血清AST、ALT、ALP、ALB 及TP 水平 與對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT 及ALP 水平升高，ALB、TP 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組大鼠血清中AST、ALT 及ALP 水平下降，高劑量組ALB、TP 水平上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2～3。

3.3 大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平 與對照組比較，模型組大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組肝組織中以上指標水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3.4 大鼠血清中MMP-9、IL-1β、IL-6 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清MMP-9、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量 組下調MMP-9、IL-1β、IL-6 水 平（P＜0.05）。見圖5～6。

3.5 大鼠肝臟指數 與對照組比較，模型組大鼠肝臟指數升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組大鼠肝臟指數降低（P＜0.05）。見圖7。

3.6 肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 的表達 與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和白背葉根水提取物中、高組抑制了大鼠肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 的表達（P＜0.05，P＜0.01）。見圖8。

圖1 HE 染色觀察各組大鼠肝組織病理改變（×100）

圖2 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠血清中AST、ALT 及ALP 的影響

圖3 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠血清中ALB、TP 的影響

3.7 肝組織中NF-κB p65 及IκBα 蛋白表達 與對照組比較，模型組NF-κB p65 蛋白表達提高（P＜0.01），IκBα 蛋白表達水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿和白背葉根水提取物中、高劑量組明顯降低NF-κB p65 蛋白表達（P＜0.01），提高IκBα 蛋白表達（P＜0.01）。見圖9～10。

圖4 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平的影響

圖5 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠血清中MMP-9 水平的影響

圖6 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠血清中IL-1β、IL-6 水平的影響

圖7 白背葉根水提取物對肝纖維化大鼠肝臟指數的影響（）

4 討論

肝纖維化是多數慢性肝臟疾病發展進程中的一個病理改變，若不及時干預則可導致肝硬化甚至肝癌［4］。目前化學合成藥物對于肝纖維化的治療效果并不理想［5］，越來越多的學者開始對傳統中草藥進行研究，以期找到更好的治療肝纖維化藥物［6-8］，本研究擬對白背葉根治療肝纖維化的作用機制進行探究。

圖8 白背葉根水提取物對肝組織中Col-Ⅰ和TNF-α mRNA 表達的影響

圖9 肝組織中NF-κBp65、IκBα 蛋白的表達水平

圖10 白背葉根水提取物對肝組織中NF-κBp65、IκBα蛋白表達水平的影響

CCl4常被用作誘導動物肝損傷及肝纖維化，其經代謝可以產生大量自由基，對肝細胞膜多不飽和脂肪酸的攻擊導致脂質過氧化［9］。肝臟受損后，ALB 及TP 合成功能受到影響，ALT、AST 和ALP 大量進入血液［10］。肝細胞受損會導致大量炎癥因子的釋放，進一步促進膠原的合成與積累［11］。PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 常被臨床用以判斷肝纖維化程度，是肝纖維化改變的敏感指標［12］。TNF-α 是一種強大的致炎因子，可聯合如IL-1β、IL-6 等細胞因子共同刺激肝星狀細胞活化，從而影響肝纖維化的啟動與發生［13］。Col-Ⅰ是細胞外基質的主要成分之一，可以代替血竇內皮下間隙的基膜，因此對肝纖維化發展中起重要作用［14］。MMP-9 是調節肝內細胞外基質降解的主要酶類之一，隨著肝纖維化程度的加深，機體代償性降解過度沉積的膠原纖維，使得MMP-9 水平增高［15］。本研究結果顯示，與模型組大鼠相比，白背葉根水提取物組大鼠血清中ALT、AST、ALP、IL-1β、IL-6 和MMP-9 的水平顯著降低，ALB、TP的水平明顯提高；同時發現Col-Ⅰ及TNF-αmRNA 表達受到抑制，提示白背葉根水提取物可能通過減輕炎癥反應及調節MMP-9 活性的途徑改善肝纖維化。

有研究表明［16］NF-κB 信號通路可以通過調節炎性細胞因子來影響肝纖維化，其異常激活可導致機體免疫、炎癥及生長反應的相關基因表達異常［17］。NF-κB 家族由5 種亞基所組成（p50、p52、cRel、p65 /RelA 和RelB）［18］。靜息細胞中，p65/p50 異源二聚體與IκBα 在細胞質中形成無活性三聚體，阻止了p65/p50 易位至細胞核［19］。當肝臟受到各種刺激源刺激，致使IκB 激酶復合物磷酸化，導致IκBα蛋白降解，破壞了無活性三聚體，釋放p65/p50 異源二聚體易位至細胞核以調節各種與肝纖維化相關的基因進行表達，最終引起肝纖維化的啟動與發展［20］。本研究表明白背葉根水提取物可以明顯抑制p65 及IκBα 蛋白的表達，提示白背葉根水提取物可以通過抑制NF-κB 信號通路的途徑抑制肝臟炎癥反應，從而發揮其改善肝纖維化的作用。

綜上所述，白背葉根水提取物可以通過抑制CCl4誘導肝纖維化大鼠肝組織中p65 及IκBα 蛋白的表達，從而抑制NF-κB 信號通路激活，使機體炎癥反應減輕，最終改善大鼠肝纖維化。但本研究缺少對NF-κB 信號通路正向及反向靶基因的研究，需進一步探索以便更加深入的闡述白背葉根水提取物抗肝纖維化的機制。