人參蛋白質對乳腺癌MCF-7 細胞的影響

任雨賀田 靜劉淑瑩萬茜淋

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.中國農業科學院特產研究所，吉林長春 130112；3.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春 130022；4.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

乳腺癌是影響婦女健康的主要惡性腫瘤，發病率位居女性惡性腫瘤之首［1］。近年來隨著社會的進步，生活方式和生殖觀念的改變以及人群期望壽命延長等諸多因素的影響，我國乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢［2］。MCF-7 是世界上研究最多的人乳腺癌細胞系，該細胞系的研究對乳腺癌的研究和患者的預后極具影響意義［3-4］。人參為五加科植物人參的干燥根，作為我國最常用、最珍貴的傳統中藥材之一，其含有人參皂苷、人參多糖、人參蛋白、揮發油等多種生物活性成分，在抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常、提高免疫力等方面均有很好的功效［5-7］。但目前對人參蛋白質的研究多集中在提取和純化上，對其生物活性的研究較少。

已有研究表明，人參蛋白質具有保護神經細胞、抗腫瘤、抗病毒等作用［8］。本實驗以人乳腺癌MCF-7 細胞為研究對象，考察人參總蛋白對MCF-7 細胞增殖、周期及凋亡的影響，以期為進一步研究人參蛋白質抗腫瘤的作用機制提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon Ri2 公司）；FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD 公司）；酶標儀（德國Tecan公司）；MCO-18AC 二氧化碳培養箱（日本松下公司）；SWCJ-1C 雙人單面超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；ST8R 臺式離心機（美國Thermo 公司）；真空冷凍干燥機（日本Eyela 公司）；SC-242D 四度醫用冷藏箱（青島海爾股份有限公司）；GR60DA 自動立式高壓滅菌鍋（美國Zealway公司）；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；層析柜（北京亞華順達科技有限公 司）；GZX-9070MBE 電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）。

1.2 試劑和藥物 人參（吉林省撫松縣3 年生生曬參）經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定符合藥典標準；DMEM 培養基（德國Sigma 公司，批號SLBT5547）；Annexin V/FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司，批號20171026）；DAPI 染色液（上海碧云天生物技術有限公司，批號C1005）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號C1052）；超級新生牛血清（NBS，中國四季青生物工程材料有限公司，批號20170824）；CCK-8 試劑盒（美國Med chem express 公司，批號06070117）。

1.3 細胞株 人乳腺癌MCF-7 細胞系，購于中國科學院上海細胞生物學研究所，由本實驗室傳代凍存。

2 方法

2.1 人參蛋白質提取 取3 年生生曬參粗粉15 g，加入Tris-HCl 緩沖液攪拌浸提18 h。離心，取上清液另存。沉淀中繼續加入Tris-HCl 緩沖液攪拌浸提18 h。離心，取上清液，與第1 次上清液合并，混勻。加入丙酮，-20 ℃下靜止過夜。離心，棄去上清液，下層沉淀揮干丙酮，凍干，即得人參蛋白質干粉，其提取率質量分數為3.29%。

2.2 細胞增殖檢測 采用CCK-8 法檢測人參蛋白質對MCF-7 細胞增殖的影響［9］。取對數生長期的MCF-7 細胞，調整細胞濃度為6×104/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板內，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。棄舊培養基，每孔加入100 μL 含藥培養基，使藥物質量濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL［10-11］，每個質量濃度設5 個復孔。繼續分別培養24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續培養2 h，于酶標儀450 nm 波長處測定吸光度，并以下列公式計算人參蛋白質對MCF-7 細胞的抑制率，平行3 次實驗。抑制率=［（OD不含藥組-OD含藥組）/（OD不含藥組-OD空白組）］×100%。

2.3 細胞周期檢測 取對數生長期的MCF-7 細胞，每孔4×105個細胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。棄舊培養基，每孔加入2 mL 含藥培養基，使藥物質量濃度分別為0、2.60 mg/mL，繼續培養48 h，收集上清液，胰酶消化，收集細胞，預冷的PBS 洗滌，加入預冷的70%乙醇，4 ℃固定24 h，預冷的PBS 洗滌，加入PI 染色液，混勻，37 ℃避光溫浴30 min，采用流式細胞儀檢測分析細胞周期。平行3 次實驗，計算各周期抑制比率。

2.4 DAPI 染色觀察細胞形態 取對數生長期的MCF-7 細胞，每孔4×105個接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h。棄舊培養基，每孔加入2 mL 含藥培養基，使藥物質量 濃度分別為 0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL，繼續培養48 h，PBS 洗滌，加入甲醇-乙酸（甲醇-乙酸=1∶1）固定液固定15 min，棄固定液，加入含0.5% Triton-100 的PBS 打孔15 min，棄PBS，加入DAPI染色液室溫避光染色5 min，PBS 洗滌，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照。

2.5 細胞凋亡檢測 取對數生長期的MCF-7 細胞，每孔4×105個接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。棄舊培養基，每孔加入2 mL 含藥培養基，使藥物濃度分別為0、2.60 mg/mL，繼續培養48 h，收集上清液，不含EDTA 的胰酶消化，收集細胞，PBS 洗滌2 次，1×Binding Buffer 重懸細胞，并分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光培養15 min，用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。平行3 次試驗，計算細胞凋亡率。

2.6 統計學分析 統計學分析取3 次重復，采用Microsoft Excel 2007 和SPSS 21.0 進行統計分析，數據均以（）表示，以P≤0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 人參蛋白質對MCF-7 細胞增殖的影響 如圖1 所示，人參蛋白質對MCF-7 細胞增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性。當使用4 mg/mL 人參蛋白質處理72 h，抑制率為79.77%。人參蛋白質作用MCF-7 細胞24、48、72 h 的IC50值分別為5.21、2.60、1.11 mg/mL。因實驗最大質量濃度為4.00 mg/mL，而24 h 的最大抑制率未達到50%，24 h 的IC50值推斷 為無效。因 此，選用作 用48 h 的IC50值2.60 mg/mL進行周期及凋亡實驗。

圖1 人參蛋白質對MCF-7 細胞增殖的影響（n＝3）

3.2 人參蛋白質對MCF-7 細胞周期的影響 如圖2 所示，與0 mg/mL 人參蛋白質組相比，2.60 mg/mL 人參蛋白質作用MCF-7 細胞48 h 后，G1 期細胞升高（P＜0.05），S 期比例無變化，而G2 期細胞下降（P＜0.01）。結果表明，人參蛋白質能夠抑制細胞從G1 期向S 及G2 期轉變，將細胞周期阻滯在G1 期，從而抑制MCF-7 細胞的增殖。

3.3 人參蛋白質對MCF-7 細胞形態的影響

3.3.1 常光下觀察MCF-7 細胞形態 如圖3 所示，人參蛋白質處理MCF-7 細胞48 h 后，0 mg/mL 人參蛋白質組的細胞生長狀態良好，形態完整，大小均一，連接緊密，且密集成片生長；隨著人參蛋白質濃度的增加，細胞數量顯著減少，形態發生變異，且懸浮細胞逐漸增多。

圖2 人參蛋白質對MCF-7 細胞周期的影響（n＝3）

3.3.2 DAPI 染色法觀察MCF-7 細胞凋亡形態 如圖4 所示，經不同質量濃度的人參蛋白質溶液處理48 h 后，0 mg/mL人參蛋白質組細胞核比較規則，染色質均勻，邊緣清晰，藍色熒光弱，略見細胞核邊緣不規則的凋亡細胞。隨著人參蛋白質濃度的增加，細胞核形態發生變化，細胞染色質發生聚集，藍色熒光增強，細胞核固縮，并出現藍色熒光的凋亡小體。

3.4 人參蛋白質對MCF-7 細胞凋亡的影響 如圖5 所示，流式細胞儀檢測的凋亡散點圖，Q1、Q2、Q3、Q4 分別代表死細胞、晚期凋亡細胞、活細胞、早期凋亡細胞。與0 mg/mL 人參蛋白質組相比，2.60 mg/mL 人參蛋白質作用MCF-7 細胞48 h 后，細胞的晚期凋亡及總凋亡比例升高（P＜0.01）。表明，人參蛋白質能夠誘導MCF-7 細胞的凋亡。

4 討論

隨著中藥受到越來越多的關注，從中藥中尋找抗癌活性成分是近年來研究的熱點［12］。中藥治療腫瘤不僅能減輕臨床不良反應，還對防治腫瘤復發轉移、增效減毒等有很好的效果［13］。中藥的抗腫瘤機制有許多方面，如抑制DNA合成、抑制腫瘤血管形成、誘導細胞分化、促進細胞凋亡、調節機體免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶活性等［14-15］。

圖3 人參蛋白質對MCF-7 細胞形態的影響

圖4 DAPI 染色觀察人參蛋白對MCF-7 細胞形態的影響

圖5 人參蛋白質對MCF-7 細胞凋亡的影響（n＝3）

已有研究表明人參蛋白質對人喉癌細胞Hep-2［16］及白血病［17］細胞均具有良好的抑制作用，但其對人乳腺癌MCF-7 細胞的作用尚未見報導。本研究通過CCK-8 實驗證明人參蛋白質能明顯抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖，且呈一定的時間和濃度依賴性。細胞周期指的是從上一次細胞有絲分裂完成至下一次有絲分裂完成的連續的全過程，調控細胞周期可阻止腫瘤細胞的異常增殖，同時保護正常細胞，是腫瘤治療的新思路［18］。本研究通過PI 染色及流式細胞儀檢測，表明人參蛋白質能夠抑制細胞從G1 期向S 及G2 期轉變，將細胞周期阻滯在G1 期，從而使細胞停止分裂，抑制MCF-7 細胞的增殖。

抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡已成為治療腫瘤的基本思路。細胞凋亡是凋亡調控基因調控細胞主動死亡的過程，具有明顯的形態學特征變化［19］。通過DAPI 染色實驗可見，與0 mg/mL 人參蛋白質組相比，2.60 mg/mL人參蛋白質組細胞形態發生變化，且染色質發生固縮，并形成凋亡小體，具有典型的凋亡形態學特征，說明人參蛋白質可以促進MCF-7 細胞的凋亡。通過Annexin V-FITC 實驗及流式細胞儀檢測，人參蛋白質加藥組的細胞凋亡率顯著高于對照組，進一步證明人參蛋白質能夠誘導人乳腺癌MCF-7 細胞的凋亡。

綜上所述，本實驗表明人參蛋白質能夠抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖，將其細胞周期阻滯在G1 期，并能誘導其細胞的凋亡。證明人參蛋白質對人乳腺癌MCF-7 細胞具有顯著的抗腫瘤作用，以期為人參蛋白質抗腫瘤機制的進一步研究及臨床應用提供了可靠的理論依據。