參苓白術(shù)散與痛瀉要方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠BMSCs 向結(jié)腸黏膜組織歸巢作用的影響

崔樹婷，劉喜平，崔國寧，李沛清，曾慶濤

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸病，目前臨床治療主要采取對癥治療及緩解癥狀［1］。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是起源于中胚層的一種非造血干細胞，研究表明移植BMSCs 使其歸巢至受損組織，參與組織修復(fù)與重建［2］，對UC 具有一定的治療作用［3］，而中醫(yī)證候存在下機體炎癥反應(yīng)外周血微環(huán)境對BMSCs 的歸巢可產(chǎn)生重要影響。據(jù)此，本研究以2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇誘導(dǎo)建立UC 大鼠模型，觀察治療UC 的常用有效方劑參苓白術(shù)散與痛瀉要方對外周血來源BMSCs 向結(jié)腸黏膜歸巢的干預(yù)作用及機制，以期闡明參苓白術(shù)散與痛瀉要方治療UC 的作用機理，同時以“以方測證”探討TNBS/乙醇誘導(dǎo)UC大鼠模型的中醫(yī)證候特征，為進一步研究BMSCs 移植治療UC 的機制及中醫(yī)藥參與BMSCs 移植治療UC 提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 參苓白術(shù)散及痛瀉要方藥材飲片購買于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定符合藥典規(guī)定。蘇木紅染液（南京建成生物科技有限公司，批號D006）；伊紅染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0109）；蘇木素（南京建成生物科技有限公司，批號D005）；中性樹脂（上海生工生物工程有限公司，批號E675007）；DMEM-F12 培養(yǎng)基（美國Gibco/Invitrogen 公司，批號HLM150312）；胎牛血清（美國Gibco/Invitrogen 公司，批號HLC0101）；胰蛋白酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號ST505）；青/鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0222）；臺盼藍粉末（德國Sigma 公司，批號HZB0368）；5% TNBS（德國Sigma 公司，批號S9951）；淋巴細胞分離液TBD（上海研謹生物科技有限公司，批號D-5879）；抗熒光淬滅劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0126）；兔來源多克隆SDF-1 抗體（英國Abcam 公司，批號ab183105）；山羊多克隆CXCR4 抗體（英國Abcam 公司，批號ab183198）。

1.2 動物 健康SPF 級SD 雄性大鼠120 只，體質(zhì)量為180～220 g，生產(chǎn)許可證號SCXK（軍）2012-0011。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、濕度40%～60%、12 h 晝夜交替環(huán)境，大鼠攝食飲水。

1.3 儀器 MCO-15AC-SC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；GSWP04700 混合纖維素濾膜（0.22 μm，美國Millipore 公司）；F513440-0001 不銹鋼細胞篩（80～200 目，上海生工生物工程有限公司）；3599 細胞培養(yǎng)瓶、3099 細胞培養(yǎng)板（美國Costar 公司）；ECLIPSE Ti-s 倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；FV3000 激光共聚焦顯微鏡（美國Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 依據(jù)參考文獻［4］，參苓白術(shù)散（炒白術(shù)、山藥、茯苓、白參各15 g，白扁豆12 g，蓮子肉、炒薏米各10 g，砂仁、桔梗各6 g，炙甘草9 g）與痛瀉要方（炒白術(shù)、炒白芍各12 g，防風(fēng)6 g，陳皮9 g），按原方比例將上述藥物飲片分別浸泡30 min，煎煮2 次，第1 次加8倍水，煎煮1 h，取煎液；第2 次加6 倍水，煎煮30 min，取煎液，2 次煎液混合濃縮，按大鼠與人體服用劑量換算，參苓白術(shù)散濃縮為含原藥材2.26 g/mL，痛瀉要方濃縮為含原藥材0.78 g/mL。

2.2 造模及給藥 120 只雄性SPF 級SD 大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機抽取30 只作為空白組，剩余90 只造成UC 模型。參考文獻［5］方法，將5%TNBS 與等體積50%乙醇混合共0.8 mL 的造膜劑，在石蠟油潤滑下經(jīng)腸管緩插8 cm 入結(jié)腸，7%水合氯醛麻醉后推注藥物，再注0.5 mL空氣，將大鼠頭朝下傾斜45°放置1 min 等其自然清醒，1 次/周，連續(xù)5 周。在確立建模成功后隨機分為空白組、模型組、參苓白術(shù)散組（生藥22.6 g/kg）、痛瀉要方組（生藥7.8 g/kg）。參苓白術(shù)散組與痛瀉要方組按照各給藥劑量灌胃給藥，給藥體積為1 mL/100 g，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)給藥28 d。

2.3 HE 染色 取全部結(jié)腸，剪取結(jié)腸黏膜組織用4% 多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制成厚約為4 μm 病理切片。HE 染色觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化，并按如下標(biāo)準(zhǔn)進行病理評分［6］，無損傷記0 分；黏膜充血、水腫且無潰瘍記1 分；黏膜輕度糜爛、充血、水腫且無潰瘍灶，記2分；黏膜中度糜爛、充血、水腫且有一個潰瘍灶，記3 分；黏膜重度糜爛、充血、水腫且多個潰瘍灶，記4 分；黏膜重度糜爛、充血、水腫且至少有一個潰瘍灶大于1 cm2，記5 分。

2.4 UC 模型大鼠外周血來源BMSCs 的分離培養(yǎng)與標(biāo)記 常規(guī)手術(shù)消毒，無菌條件下切開腹腔并暴露腹主動脈，采血針內(nèi)加入1 000 U 的肝素從腹主動脈采血5 mL，用等量的無血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋后，加到含有5 mL Ficoll-Paque Plus 液的離心管內(nèi)，用密度梯度離心法離心（2 000 r/min、20 min），吸取中間的白膜狀的淋巴細胞層，加5 倍以上體積的PBS 液洗2 次后離心（1 000 r/min、10 min）。用10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，按照細胞濃度1×106/mL 接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗3次，去除未貼壁細胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 半量換液1 次，10 d 后獲得生長融合的BMSCs，傳代培養(yǎng)，取生長良好的第3 代BMSCs，加入終質(zhì)量濃度40 μg/mL的DAPI 作為標(biāo)記物，孵育2 h 后洗滌，收集細胞備用。

2.5 激光共聚焦 各組大鼠均在灌胃結(jié)束后經(jīng)尾靜脈注射約含1×106個BMSCs 混懸液1 mL。在第7、14 天麻醉動物后取每只大鼠遠端長約8 cm 的結(jié)腸黏膜組織做冰凍切片，用4%多聚甲醛固定24 h，PBS 洗滌、封片，直接在激光共聚焦顯微鏡下觀察BMSCs 的分布（明亮藍色熒光細胞）情況，每張切片隨機選3 個視野，應(yīng)用image J pro plus 6.0 軟件分析各組BMSCs 的平均光密度值（IOD/area）。

2.6 Western blot 取各組結(jié)腸黏膜組織在液氮中研磨，加入到1.5 mL 含有蛋白酶抑制劑RIPA 的離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清于-80 ℃冰箱中保存，取200 μL 以上蛋白至新的離心管中進行蛋白定量測定，然后進行電泳，濃縮膠電壓80 V，30 min；分離膠電壓120 V，電泳2 h。PVDF 膜通過在無水甲醇溶液中搖動激活，然后轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，用封閉液將對應(yīng)的一抗SDF-1（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）稀釋，然后4 ℃孵育過夜。次日用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶1 000），然后溫育2 h。洗滌3 次，10 min/次。發(fā)光試劑A 液和B 液在避光條件下按1∶1 等體積混合配成ECL 化學(xué)發(fā)光工作液備用，用移液器均勻地平鋪到PVDF 膜正面，靜置5 min 后進行曝光。采用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer）軟件測灰度值，求蛋白質(zhì)的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示，兩組間比較采用兩樣本獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)觀察及評分 見圖1～2、表1?？瞻捉M結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)清晰，黏膜完整無缺損，黏膜上皮細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤，固有層可看到毛細血管與淋巴管細胞，杯狀細胞比較豐富，排列整齊，腸腺比較規(guī)則。模型組杯狀細胞嚴重變形，結(jié)腸黏膜缺失明顯，黏膜層與黏膜下層分界線消失，固有層腺體多數(shù)為不完整，杯狀細胞減少，部分細胞出現(xiàn)壞死，結(jié)腸黏膜炎性損傷，并有大量炎性細胞浸潤，符合UC 病理組織特征，表明TNBS/乙醇誘導(dǎo)UC 大鼠模型成功建立。經(jīng)參苓白術(shù)散與痛瀉要方治療后，黏膜上皮細胞排列比較整齊，炎性細胞浸潤明顯減少。

圖1 第7 天各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)觀察（HE，×400）

圖2 第14 天各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)觀察（HE，×400）

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理評分（）

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理評分（）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與參苓白術(shù)散組比較，△P＜0.05。

3.2 大鼠外周血來源BMSCs 在結(jié)腸黏膜組織的分布 見圖3～4、表2。各組均可檢測到DAPI 標(biāo)記的大鼠外周血來源BMSCs 在結(jié)腸黏膜組織的分布，給藥干預(yù)后，其歸巢到結(jié)腸黏膜組織的BMSCs 的數(shù)量增多。第14 天時，與空白組比較，模型組結(jié)腸黏膜組織BMSCs 升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組結(jié)腸黏膜組織 BMSCs 升高（P＜0.05），痛瀉藥方組BMSCs 更高（P＜0.05）。2 個時間段各組BMSCs 進行比較，發(fā)現(xiàn)第14 天時模型組、給藥組BMSCs 升高（P＜0.05）。

圖3 第7 天用激光共聚焦檢測各組BMSCs 的歸巢（DAPI，×400）

圖4 第14 天用激光共聚焦檢測各組BMSCs 的歸巢（DAPI，×400）

3.3 大鼠結(jié)腸黏膜組織SDF-1/CXCR4 蛋白的表達 見表3、圖5。與正常組比較，第7、14 天模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織SDF-1 蛋白表達升高（P＜0.05），第14 天模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織CXCR4 蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組比較，第7、14 天參苓白術(shù)散組及痛瀉要方組大鼠結(jié)腸黏膜組織SDF-1 蛋白表達升高，第14 天CXCR4 蛋白表達升高（P＜0.05）；痛瀉要方組明顯優(yōu)于參苓白術(shù)散組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠外周血來源BMSCs 在結(jié)腸黏膜組織的分布（）

表2 各組大鼠外周血來源BMSCs 在結(jié)腸黏膜組織的分布（）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與參苓白術(shù)散組比較，△P＜0.05；組內(nèi)第7 天比較，▼P＜0.05。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織SDF-1 和CXCR4 蛋白的表達（）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與參苓白術(shù)散組比較，△P＜0.05。

4 討論

UC 是一種免疫性疾病，其病情易于反復(fù)、遷延難愈。本病發(fā)病機制不明確，當(dāng)前研究從基因、炎癥因子、信號通路等方面探討UC 的發(fā)病機制取得了實質(zhì)進展［7］，主要和基因、遺傳、環(huán)境、情志、腸黏膜屏障破壞、腸道菌群失調(diào)等因素相關(guān)［8］；其發(fā)病原因主要是結(jié)腸黏膜的彌漫性損害，受損結(jié)腸黏膜的修復(fù)依賴于結(jié)腸黏膜干細胞。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs 具有良好的免疫調(diào)節(jié)性和多向分化性［9］，可分化為結(jié)腸黏膜干細胞，并且在特定體內(nèi)微環(huán)境的干預(yù)作用下可向結(jié)腸黏膜遷移與歸巢，從而參與受損結(jié)腸黏膜的修復(fù)，發(fā)揮治療作用［10-11］。

BMSCs 的歸巢與多種趨化因子介導(dǎo)有關(guān)。其中趨化因子CXCL12，也稱之為SDF-1，參與炎癥的調(diào)節(jié)［12］，結(jié)合G-蛋白偶聯(lián)受體CXCR4 通過多種途徑介導(dǎo)細胞的黏附、存活、增殖和基因轉(zhuǎn)錄，增強細胞內(nèi)的鈣化，從而導(dǎo)致趨化性［13］，SDF-1/CXCR4 軸在BMSCs 歸巢到受損結(jié)腸部位過程中發(fā)揮著重要作用［14］。最近研究表明CXCR4 與SDF-1在BMSCs 中高度表達，SDF-1 與CXCR4 受體結(jié)合在調(diào)節(jié)BMSCs 的歸巢過程中起重要作用［15］，進一步研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4 對多種細胞具有一定的趨化能力，其參與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 誘導(dǎo)的BMSCs 的遷移［16］。在BMSCs 移植治療急性肝衰竭的研究中發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCR4 高表達可促進其歸巢到受損組織［17］。也有研究發(fā)現(xiàn)利用慢病毒載體將CXCR4 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 來治療UC，可增強BMSCs 的歸巢及治療UC 的療效［18］。

UC 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸僻”“大瘕泄”等范疇，多由感受濕邪，或飲食所傷，或情志不暢，或勞倦過度致脾胃虛弱，濕從內(nèi)生，肝郁氣滯而成。UC 證候規(guī)律研究表明［19］，脾、肝是較常見的病位類證候要素，氣虛、濕阻、氣滯是常見的病性類證候要素，脾虛貫穿于疾病的發(fā)病始終，是其證候基礎(chǔ)，脾虛濕阻和脾虛肝郁是UC 常見證候。參苓白術(shù)散與痛瀉要方分別是治療脾虛濕阻和脾虛肝郁的常用有效方劑。本研究從UC 模型大鼠外周血成功分離到了BMSCs，表明UC 結(jié)腸黏膜炎性損傷過程中，BMSCs 已動員加入到了外周血，與空白組比較，歸巢到結(jié)腸黏膜組織的BMSCs 顯著增加，參苓白術(shù)散與痛瀉要方則能顯著促進BMSCs 向結(jié)腸黏膜組織的歸巢，痛瀉要方優(yōu)于參苓白術(shù)散租，二方促進BMSCs 歸巢作用與提高SDF-1 和CXCR4 的表達有關(guān)，這可能是二方治療UC 的作用機制之一。

方證相關(guān)是指特定方劑的功效和方劑內(nèi)的藥味及其配伍與其所對應(yīng)的證候之間存在著高度的統(tǒng)一性和針對性。本研究以TNBS/乙醇誘導(dǎo)建立UC 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散與痛瀉要方都可促進該模型外周血來源BMSCs 向結(jié)腸黏膜組織的歸巢，痛瀉要方明顯優(yōu)于參苓白術(shù)散，說明本實驗以TNBS/乙醇誘導(dǎo)建立的UC 大鼠模型傾向于中醫(yī)脾虛肝郁證，這為研究UC 發(fā)病機制提供了中醫(yī)證候模型參考。