穿心蓮內(nèi)酯對宮頸癌U14 荷瘤小鼠抗腫瘤作用的影響

魏東艷，魏冬梅，滕 利?

（1.吉林省婦幼保健院，吉林 長春 130000；2.松原市中西結(jié)合醫(yī)院，吉林 松原 138000）

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康，是導(dǎo)致女性死亡的主要病因之一［1］。手術(shù)治療是宮頸癌早期患者的主要治療手段，但很多患者在就診時已是晚期，失去了手術(shù)機會；放療也可以用于宮頸癌的治療，但其對陰道和卵巢造成不可逆的損害；而傳統(tǒng)的化療藥物有耐藥性、不良反應(yīng)等缺點，其應(yīng)用也存在較大的局限性［2］。隨著祖國醫(yī)學(xué)的發(fā)展，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中分離具有抗腫瘤活性的天然化學(xué)成分，并在其基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)修飾、改造，進而發(fā)現(xiàn)低毒、高效的抗腫瘤活性物質(zhì)，已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點領(lǐng)域［3］。

穿心蓮內(nèi)酯為二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒感染、抗炎、抗菌及保肝利膽等多種活性。研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有抗黑色素瘤、腎癌、肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌等作用［4-5］。體外實驗表明，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制宮頸癌Hela 細胞的增殖及促進凋亡，此外，順鉑與穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合使用，具有協(xié)同抑制宮頸癌Hela 細胞增殖作用［6-7］。但是穿心蓮內(nèi)酯對宮頸癌的體內(nèi)研究作用，報道較少。因此。通過建立宮頸癌U14 荷瘤小鼠模型，在明確穿心蓮內(nèi)酯具有體內(nèi)抗宮頸癌的基礎(chǔ)上，進一步探討其對免疫功能及誘導(dǎo)凋亡作用的影響，初步闡明抗宮頸癌機制。

1 材料

1.1 細胞株及實驗動物 小鼠宮頸癌U14 細胞購于美國ATCC 細胞庫；雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF 級，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）2015-0006。

1.2 試劑與藥物 穿心蓮內(nèi)酯（上海源葉生物科技有限公司，批號170511）；艾迪注射液（貴州益佰制藥股份有限公司，批號20170403）；抗小鼠CD4（批號sc-32811）、CD8（批號sc-32812）、Fas（批號sc-4856）、Fas L（批號sc-4855）及Bax（批號sc-7480）單克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；內(nèi)參蛋白抗小鼠GAPDH（批號b8-0459R）多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司。

1.3 儀器 SW-CJ-1FD 超凈工作臺（上海力辰儀器科技有限公司）；BPN-240CRH CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）；5810R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；Bio-Rad蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad 公司）；FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 造模 常規(guī)條件復(fù)蘇、培養(yǎng)保存于液氮中的U14 細胞，細胞生長至對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，每只小鼠腹腔注射0.1 mL 細胞懸液至體內(nèi)進行擴增。10 d 后，無菌條件下進行局部腹腔穿刺，抽取腹水，留存乳白色濃稠狀腹水；離心，經(jīng)Hanks 液洗滌2 次，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。取0.1 mL 細胞懸液，在小鼠右前肢腋窩部位接種，10 d 后注射部位可見米粒大小瘤塊，視為建模成功。

2.2 分組、給藥 選取造模成功的40 只荷瘤小鼠隨機分為正常對照組、模型組、艾迪注射液組（20 mg/kg）、穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組（40、20 mg/kg），每組10 只。正常對照組小鼠右前肢腋窩部位注射0.1 mL 生理鹽水；實驗期間正常對照組和模型組小鼠腹腔注射生理鹽水，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠分別腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，1 次/d，給藥周期14 d，期間密切觀察小鼠一般狀態(tài)。

2.3 檢測體質(zhì)量、瘤重、抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 各組小鼠于第14 天稱定質(zhì)量后，摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠。剝離瘤體、胸腺及脾臟，精確稱定質(zhì)量。計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤率=［（模型組腫瘤重-實驗組腫瘤重）/模型組腫瘤重］×100%，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4 檢測外周血T 淋巴細胞亞群 摘眼球取血后，肝素鈉抗凝，按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，制備細胞涂片。按照正堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶免疫復(fù)合物法（alkaline phosphotase anti-alkaline phosphotase，APAAP）檢測試劑盒中的操作說明，依次加入CD4+和CD8+單抗、對應(yīng)二抗、APAAP 復(fù)合物及底物，顯色后檢測穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠外周血T 淋巴細胞亞群的影響。

2.5 檢測瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白表達 稱取100 mg瘤組織，制備10% 組織勻漿液，BCA 法檢測總蛋白。取10 μg 總蛋白，行12% SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉2 h 后，分別加入抗小鼠Fas、Fas L 及Bax 單克隆抗體及內(nèi)參蛋白GAPDH 抗體，除GAPDH 抗體1∶1 000 倍稀釋外，其余抗體均1∶500 稀釋。4 ℃條件下放置過夜，TBST 漂洗后，加入相應(yīng)的二抗，常溫放置2 h。經(jīng)洗膜、顯色等步驟后，分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 蛋白條帶灰度值之比表示瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用2 個獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量的影響 正常對照組小鼠皮毛濃密光澤、反應(yīng)靈活、動作敏捷、精神狀態(tài)良好，模型組小鼠皮毛稀疏無光澤、反應(yīng)遲鈍、行動遲緩、精神狀態(tài)較差，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠一般狀態(tài)良好。給藥前各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥14 d 后，與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（，n＝10）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（，n＝10）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.2 穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響 給藥14 d 后，與模型組比較，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠瘤重降低（P＜0.05）；艾迪注射液組、穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組的抑瘤率分別為29.88%、21.34%、16.46%。見表2。

表2 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（，n＝10）

表2 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（，n＝10）

注：與模型組比較，?P＜0.05。

3.3 穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響給藥14 d 后，與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較（，n＝10）

表3 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較（，n＝10）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.4 穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠外周血T 淋巴細胞亞群的影響 給藥14 d 后，與正常對照組比較，模型組小鼠外周血CD4+T 淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值降低，而CD8+T淋巴細胞水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠外周血CD4+T 淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值增加，而CD8+T 淋巴細胞水平降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠外周血T 淋巴細胞亞群比較（，n＝10）

注：與正常對照比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.5 穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠瘤組織Fas、Fas L 及Bax蛋白表達的影響 給藥14 d 后，與模型組比較，艾迪注射液組及穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠瘤組織Fas、Bax 蛋白表達增加，而Fas L 蛋白表達降低（P＜0.05）。見表5、圖1。

表5 各組小鼠瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白表達比較（，n＝10）

表5 各組小鼠瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白表達比較（，n＝10）

注：與模型組比較，?P＜0.05。

圖1 Western blot 法檢測各組小鼠瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白表達

4 討論

我國藥用植物資源極為豐富，從中篩選具有抗腫瘤作用的有效成分，并明確其作用機理，對于抗腫瘤藥物的研發(fā)將具有重要意義［8］。目前，來源于植物藥的抗腫瘤制劑（如長春新堿、喜樹堿及紫杉醇等）已成為許多腫瘤化療的首選藥物［9］。本研究以宮頸癌U14 荷瘤小鼠模型為對象，通過給予穿心蓮內(nèi)酯治療后，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以改善U14 荷瘤小鼠一般狀態(tài)，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯組小鼠體質(zhì)量明顯增加，而瘤重明顯降低；以上結(jié)果提示穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用。

機體的免疫功能狀態(tài)與惡性腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密不可分，機體不同程度的免疫功能失衡是導(dǎo)致腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視，得以無限增殖的一個重要原因［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度的增加，提示穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保護作用。細胞免疫是抗腫瘤免疫的主要方式之一，當(dāng)T 淋巴細胞亞群出現(xiàn)異常時，細胞免疫功能調(diào)節(jié)失常，包括腫瘤在內(nèi)的免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生率會大大增加［11］。按照表面標(biāo)志物的不同，T淋巴細胞亞群可分為CD4+亞群和CD8+亞群，CD4+T 淋巴細胞減少會導(dǎo)致腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視，引發(fā)腫瘤細胞異常增殖；CD8+T 淋巴細胞在免疫反應(yīng)中起負向調(diào)節(jié)作用，當(dāng)CD8+T 淋巴細胞細胞增多時，有利于腫瘤生長［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予U14 荷瘤小鼠穿心蓮內(nèi)酯14 d后，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠外周血CD4+T 淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值明顯增加，而CD8+T 淋巴細胞水平明顯降低，此結(jié)果進一步表明，穿心蓮內(nèi)酯抑制U14 荷瘤小鼠腫瘤生長的作用可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

細胞凋亡過程受阻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的另一重要原因。Fas 為跨膜糖蛋白，分布于多種細胞表面，是細胞凋亡的信號分子；Fas L 是Fas 在體內(nèi)的天然配體，二者結(jié)合后，活化并傳導(dǎo)凋亡信號，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡［13］。研究表明，F(xiàn)as 蛋白的表達與腫瘤細胞的凋亡水平呈正相關(guān)，而Fas L 蛋白表達與腫瘤細胞凋亡呈負［14］。Bax 是Bcl-2 家族蛋白中的重要促凋亡蛋白，其可以通過調(diào)控細胞凋亡來發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長狀態(tài)的作用［15］。本研究采用Western blot 法檢測了穿心蓮內(nèi)酯對各組小鼠瘤組織Fas、Fas L 及Bax 蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組小鼠瘤組織Fas 及Bax 蛋白表達明顯增加，而Fas L 蛋白表達明顯降低，以上結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯可以誘導(dǎo)U14荷瘤小鼠腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯對U14 荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，其機制與提高免疫力及誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)。