HPLC 法測定丁樸凝膠貼膏中3 種成分

王奕博，杜媛媛，于穎超，曲昌海，尹興斌，董曉旭，孫毅坤，倪 健

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.北京中醫藥大學中醫藥研究院，北京 100029）

丁樸凝膠貼膏是以北京中醫藥大學東方醫院臨床經驗方——“胃癱外敷方”為基礎，原劑型為中藥細粉與蜂蜜等黏合劑混合成外敷制劑，現將其改為凝膠貼膏劑。該方臨床應用多年，尤其對寒癥型術后胃癱患者效果顯著［1-2］，它由丁香、姜厚樸、肉桂等中藥組成，所含丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚等成分具有促進胃腸蠕動、保護胃黏膜、增強胃動力的作用［3-7］。本實驗建立HPLC 法測定這3 種成分的含有量。

凝膠貼膏性質黏稠，而且部分高分子材料不溶于有機試劑，不同方法對其提取率有較大影響。目前，相關提取方法包括冷浸法、超聲法、分散后再處理法［8-11］，但鮮有對其所得提取率進行比較，故本實驗又考察了超聲時間、冷浸時間、溶劑量、是否分散對丁樸凝膠貼膏提取率的影響，以期為后續研究提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀（配置SPD-M20A PDA 檢測器，日本島津公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；TLE204102型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JY5002 型電子天平（上海衡平儀器儀表廠）。

1.2 試劑與藥物 桂皮醛（批號110710-201720，質量分數98.7%）、丁香酚（批號110725-201716，質量分數99.6%）、和厚樸酚（批號110730-201614，質量分 數99.3%）、厚樸酚（批號 110729-201714，質量分 數100.0%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。凝膠貼膏及缺肉桂、丁香、厚樸陰性貼膏均為自制。硅藻土（天津市福晨化學試劑廠，批號20180320）。甲醇為色譜純（美國Fisher 公司）或分析純（北京化工廠）；水為純凈水（娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 凝膠貼膏制備 取處方量聚丙烯酸鈉、氫氧化鋁，混合均勻后加入甘油、中藥揮發油攪拌均勻，作為油相；取處方量酒石酸、純凈水、厚樸流浸膏攪拌均勻，作為水相；將水相均勻加到油相中，以60 r/min 左右轉速攪拌成型后置于無紡布上，將膏體均勻涂布于自制涂布框內，加蓋壓花膜，室溫靜置，即得（生藥量15 g/貼）。

2.2 指標成分含有量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長290 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 取自制凝膠貼膏，揭下壓花膜，不銹鋼勺刮取0.5 g 置于蒸發皿中，精密稱定質量，加入等量硅藻土，以鋼勺不斷擠壓攪拌至硅藻土與凝膠貼膏完全混勻，具體表現為貼膏外觀類似絮狀且黏性消失，即為分散完成。將其置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲（100 W、40 kHz）10 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含四者0.107 24、1.073、0.158 6、0.334 mg，搖勻，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取等量缺肉桂、缺丁香、缺厚樸陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取供試品、對照品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、6.0 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 分別為0.44%、0.50%、0.56%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 稱取凝膠貼膏約0.5 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚含有量RSD 分別為2.78%、2.73%、2.27%、1.61%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取供試品溶液，于0、1、3、6、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 分別為2.59%、0.48%、1.42%、1.20%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批含有量已知的凝膠貼膏0.5 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，加入對照品溶液后在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，桂皮醛平均加樣回收率為92.03%，RSD 為4.14%；丁香酚平均加樣回收率為98.03%，RSD 為1.56%；和厚樸酚平均加樣回收率為98.31%，RSD 為2.10%；厚樸酚平均加樣回收率為99.06%，RSD 為1.32%。

2.3 提取方式考察

2.3.1 凝膠貼膏制備 取適量丁香、肉桂混合揮發油及厚樸流浸膏，加入處方量輔料，即得（每1 g 含丁香酚7.69 mg、桂皮醛1.28 mg、和厚樸酚1.05 mg、厚樸酚2.03 mg）。

2.3.2 正交試驗 取0.5 g 凝膠貼膏，分別加入規定量硅藻土分散或不分散，并加50 mL 甲醇超聲或冷浸規定時間，以丁香酚、厚樸酚、和厚樸酚平均提取率為評價指標，考察硅藻土分散比（A）、超聲時間（B）、冷浸時間（C）對其的影響，因素水平見表3，結果見表4。由此可知，除A1B1C1外，各組合所得提取率相差不大，推測這3 個因素之間可能存在相互作用，故對其進行單因素試驗考察。

表3 因素水平

表4 試驗設計與結果

2.3.3 料液比、冷浸時間 取凝膠貼膏0.5、1、2 g，加50 mL 甲醇（即料液比1∶100、1∶50、1∶25）冷浸后，于10、20、30、60、120、180、240、360、480、600、720、1 440 min 各取樣1 mL，甲醇補足減失的質量，計算提取率，平行3 次，取平均值，結果見圖2。由此可知，料液比1∶100、冷浸時間2 h 時可得到90%以上的提取率。

圖2 不同料液比下冷浸時間對提取率的影響

2.3.4 不分散后超聲時間 取凝膠貼膏0.5 g，加50 mL甲醇超聲后，于10、20、30、40 min 各取樣1 mL，甲醇補足減失的質量，計算提取率，平行5 次，取平均值，結果見圖3。由此可知，提取40 min 時提取率仍不能達到90%，而且不同提取時間之間差異較大。

圖3 不分散后超聲時間對提取率的影響

2.3.5 分散后超聲時間 取凝膠貼膏0.5 g，加等量硅藻土分散，加50 mL 甲醇超聲后于10、20、30、40 min 各取樣1 mL，甲醇補足減失的質量，計算提取率，平行5 次，取平均值，結果見圖4。由此可知，提取10 min 時提取率即可達90%以上，而且不同提取時間之間差異較小，故確定最優提取方法為加1 倍量硅藻土分散后超聲10 min。

圖4 分散后超聲時間對提取率的影響

2.3.6 樣品含有量測定 制備3 批樣品，按上述方法進行測定，每批3 次。結果，丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚平均含有量分別為7.54、1.00、1.79 mg/g。

3 討論

本實驗對丁樸凝膠貼膏中桂皮醛也進行了分析，發現在貼膏制備過程中其失達40%，即使保證避光條件其平均加樣回收率亦僅為92.03%。桂皮醛在甲醇中的穩定性較差，而且樣品分散可能導致其損失，故在提取含該成分的凝膠貼膏時應避免使用硅藻土，同時提取溶液可選擇乙腈［12-13］。

考察冷浸時間時發現，取樣量0.5、1、2 g 條件下所得提取率大致相同，而貼膏體積越大，所需冷浸時間越長。然后，對三者對未達到穩態部分的釋放曲線進行擬合，發現均符合一級動力學方程（r分別為0.970 0、0.990 3、0.991 4），表明凝膠貼膏在有機試劑中并不會產生溶蝕作用，僅是類似于一種固體［14］，成分由內而外被動擴散，進而解釋了不分散時為何需要長時間超聲才能達到90%以上提取率。

考察檢測波長時發現，290 nm 下桂皮醛、丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積大小適中，故確定其作為檢測波長。

不使用硅藻土分散冷浸2 h 以上后，可充分提取0.5 g小塊凝膠貼膏，并且貼膏體積越大，所需冷浸時間越長，雖然超聲提取有助于指標成分溶出，但也需要長時間才能達到90%以上提取率，同時RSD 也較大，其原因可能是不分散時凝膠貼膏性質黏稠，取樣表面積差異較大，導致擴散速度不同，從而放大誤差；使用硅藻土分散后超聲10、40 min 時，所得提取率基本接近，RSD 較小，為了節約時間、降低誤差，本實驗選擇分散后超聲提取10 min。

4 結論

本實驗通過HPLC 法測定丁樸凝膠貼膏中丁香酚、和厚樸酚、厚樸酚的含有量，其專屬性、精密度、重復性、穩定性、準確性均符合2015 年版《中國藥典》 藥品質量標準分析方法驗證指導原則規定，可為該制劑質量控制提供參考。