芩黃凝膠劑精制工藝的優化

林 雄，嚴國鴻，潘旭東，黃 燕，鐘樹仁

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

芩黃凝膠劑是在福建中醫藥大學附屬人民醫院蛇傷救治中心特色制劑“三黃散”（批準文號閩藥制字Z06106062）的基礎上改進而成的水性外用凝膠劑，具有清熱解毒、消炎鎮痛的功效，臨床上用于治療毒蛇咬傷，相較于原藥調配繁瑣、使用不便、易導致患者疼痛難忍、出現過敏癥狀等弊端，它具有使用舒適方便、藥物作用時間長、對皮膚無刺激作用等優點。該方由黃芩、大黃組成，兩者共為君藥，其中前者具有清熱燥濕、涼血安胎、瀉火解毒等功效，主要成分黃芩苷具有抗炎抗菌、抗過敏等作用［1］；后者具有瀉下攻積、清熱瀉火、止血解毒、活血祛瘀等功效，主要成分大黃蒽醌具有解熱鎮痛、抗菌消炎等作用［2］。本實驗在前期研究確定的最佳提取工藝基礎上，采用正交試驗結合多指標綜合評分優化芩黃凝膠劑精制工藝，為該制劑最佳制備工藝的研究奠定基礎。

1 材料

Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安公司）；CPA225D 電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZT-5 L 旋轉蒸發儀（上海增森儀器科技有限公司）。

大黃素、大黃酸、大黃酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110756-201512、110757-201607、110796-201621）；蘆薈大黃素、大黃素甲醚、黃芩苷對照品（美國CATO 標準品，批號分別為CE-11-16、CE-11-17、CE-11-15）。大黃（安徽協和成藥業飲品有限公司，產地甘肅，批號17113015）、黃芩（亳州市瀘譙藥業有限公司，產地山西，批號1709100132）經福建中醫藥大學附屬人民醫院鄢英慧副主任中藥師鑒定為正品，符合2015 版《中國藥典》 一部項下要求。殼聚糖（黏度200～400 mPa·s，上海麥克林生化科技有限公司）。甲醇為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；水為經0.45 μm微孔濾膜過濾的純化水。

2 方法與結果

依據前期實驗結果，結合文獻［3-10］確定藥液醇沉和殼聚糖澄清正交試驗設計方案，以黃芩中黃芩苷和大黃中蒽醌類成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）轉移率為評價指標，采用多指標綜合評分進行考察，確定黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的權重系數分別為0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1。

2.1 正交試驗

2.1.1 提取液制備 稱取處方量藥材，加6 倍量水浸泡0.5 h后回流提取2 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，即得，減壓濃縮備用。

2.1.2 醇沉工藝設計 選用L9（34）正交表，以醇沉體積分數、藥液質量濃度、靜置時間、攪拌速度為影響因素，每個因素3 個水平，見表1。

2.1.3 澄清工藝設計 選用L9（34）正交表，以藥液質量濃度、1%殼聚糖加入量、沉淀溫度、靜置時間為影響因素，每個因素3 個水平，見表2。

表1 醇沉工藝因素水平

表2 澄清工藝因素水平

2.2 黃芩苷含有量測定

2.2.1 色譜條件 Amethyst C18-H 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（57∶43）；檢測波長280 nm；柱溫50 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取黃芩苷對照品適量，置于100 mL 量瓶中，甲醇定容至1.064 mg/mL，精密吸取5 mL置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至212.80 μg/mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.2.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定。以黃芩苷質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=0.629 1X-2.378（r=0.999 8），在10.64～212.80 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 分別按醇沉、澄清工藝制得藥液后各精密吸取1.0 mL，稀釋至100 mL，再精密吸取1.0 mL，甲醇定容至10 mL，超聲30 min，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 取缺黃芩處方量藥材，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 重復性試驗 精密吸取同一精制藥液1 mL，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣各10 μL 測定，測得黃芩苷峰面積RSD為2.45%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的精制藥液0.5 mL，精密加入10.0 mL 貯備液，按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃芩苷平均加樣回收率為101.2%，RSD 為1.97%。

2.2.7 專屬性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖1，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

2.3 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含有量測定

2.3.1 色譜條件 Amethyst C18-H 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；檢測波長430 nm；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關系考察 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置于50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，制得質量濃度分別為202.20、204.00、211.20、395.20、201.00 μg/mL 的貯備液，精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程分別為蘆薈大黃素Y=0.475 1X-0.046 7（r=0.999 9），線性范圍2.022～101.1 μg/mL；大黃酸Y=0.470 2X-1.188 4（r=0.999 4），線性范 圍2.040～102.0 μg/mL；大黃素Y=0.435 2X-0.014 1（r=0.999 9），線性范圍2.112～105.6 μg/mL；大黃酚Y=0.491 1X+0.006 6（r=0.999 9），線性范圍3.952～197.6 μg/mL；大黃素甲醚Y=0.411 9X+0.288 9（r=0.999 4），線性范圍2.010～100.5 μg/mL。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取精制藥液1.0 mL，加入8%鹽酸、三氯甲烷各10 mL，回流提取1 h，放冷，轉移至分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，取三氯甲烷層，剩余藥液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，揮干溶劑，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備 稱取缺大黃處方量藥材，按“2.3.3”項下方法制備，即得。

2.3.5 重復性試驗 精密吸取同一精制藥液1.0 mL，平行6 份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為1.59%、1.14%、1.93%、1.65%、1.86%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的精制藥液1 mL，平行6 份，精密加入對照品溶液 ［蘆薈大黃素（203.50 μg/mL）0.8 mL、大黃酸（217.15 μg/mL）1.1 mL、大黃素（204.2 μg/mL）0.9 mL、大黃酚（385.56 μg/mL）0.9 mL、大黃素甲醚（200.44 μg/mL）0.4 mL］，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為101.2%（RSD=1.95%）、100.6%（RSD=1.97%）、101.2%（RSD=2.11%）、99.9%（RSD=1.60%）、98.7%（RSD=2.37%）。

2.3.7 專屬性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，每個樣品平行2 次，色譜圖見圖2，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖2 大黃蒽醌HPLC 色譜圖

2.4 試驗結果 通過多指標綜合加權評分法（權重系數同上）進行直觀分析和方差分析，綜合評分（X）［11］計算公式為X=0.5a+0.1b+0.1c+0.1d+0.1e+0.1f，其中a=黃芩苷轉移率/最大值×100、b=蘆薈大黃素轉移率/最大值×100、c=大黃酸轉移率/最大值×100、d=大黃素轉移率/最大值×100、e=大黃酚轉移率/最大值×100、f=大黃素甲醚轉移率/最大值×100。結果見表3～6。

表3 醇沉工藝正交試驗結果

表4 醇沉工藝方差分析

表5 澄清工藝正交試驗結果

表6 澄清工藝方差分析

由此可知，醇沉工藝中各因素影響程度依次為A（醇沉體積分數）＞B（藥液質量濃度）＞D（攪拌速度）＞C（靜置時間），其中A、B、D有顯著影響（P＜0.05），而C無顯著影響（P＞0.05），最佳條件為A1B1C2D3，即醇沉體積分數50%，藥液質量濃度0.8 g/mL，靜置時間48 h，攪拌速度180 r/min。澄清工藝中各因素影響程度依次為A（藥液質量濃度）＞B（1% 殼聚糖加入量）＞C（沉淀溫度）＞D（靜置時間），其中A有顯著影響（P＜0.05），而B、C、D無顯著影響（P＞0.05），最佳條件為A1B1C1D1，即藥液質量濃度0.25 g/mL，1%殼聚糖加入量10%，沉淀溫度40 ℃，靜置時間24 h。

2.5 驗證試驗 分別按最佳醇沉、澄清工藝進行3 批驗證試驗，結果見表7～8，可知該方法穩定可靠。

表7 醇沉工藝驗證試驗結果（n ＝3）

表8 澄清工藝驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

在檢測大黃蒽醌［12］過程中發現，檢測波長254 nm 下采用等度梯度或梯度洗脫時，待測成分與干擾成分均無法實現良好分離，這是因為該類成分在254、430 nm 波長下均有最大吸收［13］。經研究顯示，色譜條件為流動相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）、檢測波長430 nm、柱溫40 ℃時，待測成分分離效果最理想。

芩黃凝膠劑為多種成分組成的中藥復方制劑，由黃芩、大黃組成，兩者配伍相須相使，共為君藥，故選擇其主要有效成分作為待測指標，但若僅單獨選擇黃芩苷或大黃蒽醌作為檢測指標，則無法全面評價工藝。因此，本實驗采用正交試驗結合多指標綜合評分，既能更準確反應工藝優劣，又可有效減少工作量，綜合考慮黃芩、大黃在制劑處方中的用量和作用，將黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚權重系數分別設定為0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1，更加合理可行。同時，本實驗選擇黃芩苷、大黃蒽醌轉移率而非其含有量作為評價指標，能更客觀地體現精制工藝在芩黃凝膠劑制備過程中所發揮的作用，有利于該制劑內在質量控制。