芩麻顆粒前處理工藝的優化

張 依李 婷丁 越鄒純樸田娟娟張 彤?

（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；2.上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203；3.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203）

芩麻方是國醫大師裘沛然教授的臨床經驗方，經小青龍湯演變而來，主要由麻黃、黃芩、甘草等7 味中藥組成，具有寒熱并用、斂散相伍的配伍特征，主治寒邪痰熱內蘊之哮喘、咳嗽，臨床上主要用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎等病癥［1］，該方臨床使用已有四十多年，具有較好的療效和安全性。支氣管哮喘作為一種最常見的慢性呼吸道疾病［2-3］，其治療不僅消耗了大量衛生資源，而且因勞動力喪失導致嚴重的社會經濟負擔，目前全球約有3 億患者，所造成的疾病負擔占全球所有疾病傷殘調整生命年的1%，與糖尿病相當［4］，其特征是反復發作的呼吸困難和喘息，嚴重程度和發生頻率因人而異［5-6］。目前，臨床治療支氣管哮喘以激素藥物治療為主，如糖皮質激素、β2-受體激動劑、白三烯受體拮抗劑、茶堿類藥物等［7-8］，這些藥物雖然起效快，但存在許多副作用及不良反應，不適合長期服用；芩麻方臨床上表現出長效、低毒、副作用少等優勢［9］，故按照中藥現代化的要求將芩麻方其成攜帶、服用方便的顆粒劑，將有利于該類疾病的治療。

芩麻方中主要成分為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、沒食子酸、黃芩苷、龍膽苦苷等［10-13］，其中黃芩苷具有治療支氣管哮喘、抑菌、利尿、抗炎、抗變態作用［14-15］。因此，故本實驗采用HPLC 法測定芩麻顆粒中黃芩苷含有量，不僅考察了該成分提取方法，并比較了不同品牌、材質微孔濾膜對黃芩苷的吸附作用，以及高速離心、微孔濾膜濾過法對黃芩苷的前處理效果，為該制劑后續研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材 黃芩（產地山西，批號161122）、麻黃（產地內蒙，批號 160812）、甘草（產地甘肅，批號161215）、干姜（產地山東，批號161117）、龍膽（產地云南，批號160906）、細辛（產地遼寧，批號161216）、訶子（產地廣西，批號161220）均購于上海虹橋中藥飲片有限公司，經上海中醫藥大學教學實驗中心宋龍博士鑒定為正品。

1.2 試劑與藥物 芩麻顆粒（批號171203）由中藥現代化生產中試（孵化）基地生產。黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-200815，質量分數93.5%）。0.45 μm 尼龍微孔濾膜和0.45 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜購于上海安譜實驗科技股份有限公司、迪馬科技有限公司、美國安捷倫科技公司、天津市領航實驗設備有限公司、天津萊博飛特生物科技有限公司、上海泰坦科技股份有限公司。甲醇為色譜純（美國Sigma-Aldrich 公司）；95%乙醇、無水乙醇、甲醇、磷酸均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；水為雙蒸餾水。

1.3 儀器 BS124S 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JA5002 電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Agilent Technologies 1200 Series 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；TGL-16B 低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DZF-6050 真空干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；SB-5200D 超聲波清洗機（寧波新藝生物科技股份有限公司）；HHS 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取黃芩苷對照品適量，75%甲醇制成高（339.6 μg/mL）、中（33.96 μg/mL）、低（3.396 μg/mL）質量濃度的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，稱定質量，超聲提取20 min，冷卻至室溫后75%甲醇補足減失的質量，15 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.1.3 色譜條件 迪馬-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.3% 磷酸（B），等度洗脫（50∶50）25 min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，黃芩苷能與其他組分完全分離（R≥1.5），理論塔板數按該成分色譜峰計不低于2 500。

2.1.4 線性關系考察 取黃芩苷對照品溶液適量，75%甲醇稀釋成325.4、260.3、195.2、130.2、65.08、32.54、13.02、6.508、3.254 μg/mL，各精密吸取10 μL，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=36.871X-60.518（r=0.999 7），在3.254～325.4 μg/mL 范圍內線性關系良好。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖

2.1.5 精密度試驗 精密吸取高、中、低質量濃度的黃芩苷對照品溶液各10 μL，同一天內在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定6 次，計算日內精密度；連續3 d，計算日間精密度。結果，日內、日間精密度RSD 分別小于1.0%、0.9%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取顆粒適量，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷含有量RSD 為0.5%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷峰面積RSD 為1.3%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取黃芩苷含有量已知的顆粒，分別加入相當于該成分含有量80%、100%、120% 的對照品溶液，按“2.1.2”項下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

2.2 前處理工藝優化

2.2.1 顆粒研磨 顆粒研磨成細粉（過80 目篩），取約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲（300 W、25 kHz）提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補足減失的質量，收集提取液；另取顆粒，不研細，取約0.2 g，精密稱定，同法處理，15 000 r/min 離心10 min，測定黃芩苷含有量，結果見表2。由此可知，顆粒研磨前后黃芩苷含有量無明顯變化，可能是該成分在50% 甲醇中溶解性較好，但考慮到顆粒研磨過程中容易吸潮，稱量操作不便，故選擇不研磨而直接提取。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗結果（n＝3）

表2 顆粒研磨對黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.2 提取方法 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，稱定質量，分別超聲、回流、60 ℃水浴熱浸提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50% 甲醇補足減失的質量，收集提取液，15 000 r/min離心10 min，測定黃芩苷含有量，結果見表3。由此可知，超聲、回流提取下黃芩苷含有量高于熱浸法，但兩者無明顯差異，故選擇操作更簡便的超聲提取。

表3 提取方法對黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.3 提取溶劑種類 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入水、乙醇、甲醇、25% 甲醇、50%甲醇、75%甲醇各100 mL，稱定質量，超聲提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補足減失的質量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測定黃芩苷含有量，結果見表4。由此可知，75%甲醇提取時黃芩苷含有量最高，故選擇該溶劑。

2.2.4 提取溶劑體積 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50、100、250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入10、25、50、100 mL 75%甲醇，稱定質量，超聲提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50% 甲醇補足減失的質量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測定黃芩苷含有量，結果見表5。由此可知，25 mL 提取時黃芩苷含有量最高，故選擇該體積。

表4 提取溶劑種類對黃芩苷含有量的影響（n＝3）

表5 提取溶劑體積對黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.5 提取時間 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，稱定質量，超聲提取5、10、20、30、60 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補足減失的質量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測定黃芩苷含有量，結果見表6。由此可知，提取20 min 后黃芩苷含有量無明顯變化，考慮到效率因素，故選擇提取時間20 min。

表6 提取時間對黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.3 提取液除雜 采用HPLC 法測定提取液中成分含有量時，一般需采用微孔濾膜或超速離心去除懸浮粒子，以免堵塞色譜柱。通過預實驗發現，微孔濾膜處理顆粒提取液時對黃芩苷具有一定吸附性，而且不同材質的吸附性有所差異，故有必要比較微孔濾膜、超速離心的處理效果，以及兩者對黃芩苷吸附性的影響。

取“2.1.1”項下對照品溶液、“2.1.2”項下供試品溶液適量，15 000 r/min 離心10 min；另取2 種溶液適量，經不同品牌、材料0.45 μm 微孔濾膜過濾，測定黃芩苷含有量，計算其轉移率，結果見圖2，可知迪馬科技有限公司所生產的0.45 μm 尼龍微孔濾膜，以及上海安譜實驗科技股份有限公司、安捷倫科技有限公司所生產的0.45 μm聚四氟乙烯微孔濾膜對黃芩苷的吸附最少；同一品牌中，聚四氟乙烯濾膜對該成分的吸附明顯少于尼龍濾膜。另外，與微孔濾膜法相比，高速離心法所得黃芩苷的轉移率較高，故提取液前處理方法可采用該方法；如果采用微孔濾膜法，則可選擇上海安譜實驗科技股份有限公司、安捷倫科技有限公司所生產的0.45 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜進行過濾。

圖2 不同品牌、材料0.45 μm 微孔濾膜對黃芩苷轉移率的影響

3 討論與結論

本實驗在處理芩麻顆粒提取液時發現，不同廠家、材料的0.45 μm 微孔濾膜對黃芩苷均有一定吸附性，故考察了不同品牌尼龍濾膜，以及同一品牌尼龍、聚四氟乙烯濾膜對該成分的吸附效果，發現由迪馬科技有限公司生產的尼龍濾膜吸附量較小，成分轉移率為81.76%～96.57%；聚四氟乙烯濾膜的吸附率相對較低，以安捷倫科技有限公司、上海安譜實驗科技股份有限公司生產的最明顯，成分轉移率均高于95%。然后，將33.96 μg/mL 黃芩苷對照品溶液經天津市領航實驗設備有限公司、天津萊博飛特生物科技有限公司生產的0.45 μm 尼龍微孔濾膜過濾，發現吸附率分別為37.60%、48.44%，2 倍體積甲醇洗脫后其回收率分別為93.05%、90.44%，進一步證明了以上2 個品牌較強的吸附性。目前，市場上有機相微孔濾膜的材料大多以尼龍為主，提示研究人員在進行類似實驗時需要關注微孔濾膜對目標成分的吸附作用，從而選擇更合適的提取液除雜方法。

綜上所述，本實驗不僅優化了芩麻顆粒前處理工藝，并成功建立其主要成分黃芩苷含有量的測定方法。同時，還首次發現微孔濾膜對芩麻顆粒中黃芩苷的吸附作用，并對目前市面上常見的微孔濾膜進行評估，為相關研究提供了重要的實驗依據。