基于網絡藥理學的荊銀顆粒治療病毒性感冒作用機制研究

俞 婷劉新娟劉 力高 崎

（1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021；3.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 201703）

荊銀顆粒是由荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風、甘草9 味藥組成，多為解表藥，具有解毒、鎮痛、抗炎的作用［1-5］。研究［6］表明，該處方體內外均具有良好的抗病毒作用，如RSV（RNA 病毒）、ADV3（DNA 病毒）。方中荊芥、金銀花為君藥；四季青、魚腥草、大青葉為臣藥；蒲公英、牛蒡子、防風為佐藥；甘草為使藥，調和諸藥。荊芥為唇形科荊芥屬植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq 的干燥地上部分，又稱假蘇，始記于《神農本草經》 被列為中品［7］。該藥物中含有多種揮發油成分及黃酮類成分，主要具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏的藥理作用［8］。金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或初開的花。金銀花一名出自《本草綱目》，其富含揮發油、黃酮和有機酸類成分［9-10］，自古具有清熱解毒作用，在荊銀顆粒中與荊芥同為君藥，增強抗病毒作用［11-12］。

冠狀病毒感染引起的肺炎是由病毒感染引起，與流感的起因及癥狀極其相似。荊銀顆粒作為抗非典型性肺炎的處方，方中藥物較多，成分復雜，而現代網絡藥理學適用于多成分多靶點的中藥、方劑機制研究，如杜葉青等［13］應用網絡藥理的方法對金銀花的抗炎作用機制進行預測研究；袁岸等［14］采用了網絡藥理學的方法，構建“成分-靶點-通路”網絡，預測荊芥的抗炎作用；朱梓銘等［15］通過網絡藥理學的方法探究了苓桂術甘湯治療慢性心力衰竭的作用機制。荊銀顆粒具有較強的抗病毒作用，但其作用機制尚不明確，因此本研究通過網絡藥理學探究荊銀顆粒抗病毒的主要作用機制，為今后荊銀顆粒用于臨床預防治療冠狀病毒感染引起的肺炎提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 荊銀顆粒活性成分和成分靶點的收集 在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中藥分子機制生物信息學分析工具BATMANTCM 數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）搜索荊銀顆粒9 味藥的所有化學成分，以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數中的口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，得到荊銀顆粒的活性成分。同時在TCMSP 和BATMAN-TCM 中查詢得到活性成分所對應靶點，并在UniProt 數據庫將靶點蛋白轉化為對應的基因名（Gene names）。

1.2 流感疾病靶點獲取 應用 Drugbank 數據庫（https：//www.drugbank.ca/ ）和 DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/），輸入關鍵詞“Influenza”查詢得到流感相關靶點。將活性成分作用靶點與流感相關靶點取交集，得到荊銀顆粒活性成分抗病毒的關鍵靶點。

1.3 “活性成分-關鍵靶點”網絡構建與分析 活性成分與關鍵靶點導入Cytoscape 3.6.0 軟件，構建“活性成分-關鍵靶點”網絡，并應用Cytoscape 中“Network Analyzer”功能進行網絡分析，根據Degree 值篩選荊銀顆粒抗病毒的重要成分。

1.4 關鍵靶點蛋白相互作用（PPI）網絡的構建與分析 將關鍵靶點導入String 數據庫，限定物種為人，設定置信度≥0.9，得到的文本數據，整理后導入Cytoscape3.6.0 軟件構建PPI 網絡，并應用“Network Analyzer”功能進行網絡拓撲指標分析，篩選Degree 值高于平均值的重要靶點。

1.5 生物功能和通路分析 應用Cytoscape 3.6.0 軟件中的ClueGO 插件對關鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析，設置P≤0.05。

1.6 分子對接驗證 Swiss Dock 在線分子對接軟件，可以用來預測一個目標蛋白和一個小分子之間可能發生的分子相互作用。根據“活性成分-關鍵靶點”網絡中重要的成分和PPI 網絡中重要的靶蛋白，應用Swiss Dock 進行分子對接驗證，用以評價活性成分與關鍵靶點之間的對接效果。

2 結果

2.1 荊銀顆粒藥物與疾病相關基因 從TCMSP 中獲取荊銀顆粒8 味藥（除蒲公英）174 種活性成分，在BATMANTCM 獲取蒲公英的8 種活性成分（表1），刪去重復共得到荊銀顆粒9 味藥160 種活性成分，并且獲得活性成分324個作用靶點。獲得流感相關靶點621 個，通過Venn 圖刪去重復項得到73 個關鍵靶點（圖1）。

表1 荊銀顆粒9 味藥160 種活性成分

圖1 活性成分-關鍵靶點和流感靶點Venn 圖

2.2 “活性成分-關鍵靶點”網絡構建與分析 將9 味中藥對應的160 種活性成分與73 個靶點在Cytoscape 3.6.0 軟件中構建荊銀顆粒抗病毒的“活性成分-關鍵靶點”網絡圖（圖2）。網絡中共涉及176 個節點和422 條邊，其中圓形代表活性成分，菱形代表關鍵靶點。成分進行度值（Degree）評價，篩選重要成分共17 種，分別是槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚、柚皮素等，Degree 值較高的成分可能是荊銀顆粒抗病毒的關鍵成分（表2）。

2.3 PPI 網絡構建與分析 將73 個關鍵靶蛋白導入String數據庫，限定物種為人，設定置信度≥0.9，在Cytoscape軟件構建PPI 網絡（圖3），該網絡共涉及61 個節點和237條邊，節點表示靶點，邊表示蛋白與蛋白之間相互作用，節點大小與顏色表示Degree 值大小，Degree 值由小到大，則節點從小到大。共有27 個靶蛋白Degree 值高于平均值（表3），其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等靶點蛋白Degree 值較大，表明與其他蛋白相互作用較強，因此這些蛋白在網絡中具有重要作用。

圖2 活性成分-關鍵靶點網絡圖

表2 荊銀顆粒抗病毒中17 種活性成分

圖3 73 個關鍵靶點PPI 網絡

2.4 生物功能和通路分析 在Cytoscape 3.6.0 軟件中應用ClueGO 插件對73 個關鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析，設置P≤0.05，得到可視化分析餅狀圖（圖4～5），73 個靶點主要富集在脂多糖反應（response to lipapolysaccharide）、趨向化正向調節（positive regulation of chemotaxis）、對紫外線的反應（response to UV）、單核細胞遷移調 節（regulation of mononuclear cell migration）、JAK-STAT級聯反應（JAK-STAT cascade）等生物過程。

KEGG 通路圖表明荊銀顆粒抗病毒的最主要作用通路是白細胞介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway），同時還包括甲狀腺激素合成（thyroid homone synthesis）、肌萎縮側索硬化癥［amyotrophic lateral sclerosis（ALS）］、細胞凋亡（apoptosis）、B 細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）等。

表3 Degree 值高于平均值的27 個靶蛋白

2.5 分子對接驗證 選擇荊銀顆粒成分中含有量較高的木犀草素和靛玉紅，以及指標性測定成分原兒茶醛，與PPI網絡中的前2 個關鍵靶點RELA 和JUN，在PDB 數據庫下載靶點晶體結構文件，用Pymol 軟件移去水分子和配體分子。在Swiss Dock 在線軟件分別上傳靶蛋白和木犀草素、靛玉紅以及原兒茶醛的結構文件。分子對接結果見表4，蛋白質與小分子結合越緊密，Full Fitness 值越低。結果表明3個成分與兩個靶蛋白都可對接（圖6～11），其中RELA 與木犀草素、JUN 與靛玉紅、JUN 與原兒茶醛對接效果最好。

表4 分子對接結果

3 討論

荊銀顆粒作為治療感冒和急性肺炎、支氣管周圍炎（屬風熱犯肺證）的常規制劑，藥理研究已證明在抗病毒方面有顯著的作用，因此利用網絡藥理學方法研究荊銀顆粒抗病毒作用機制具有重要意義。

圖4 關鍵靶點GO 生物功能注釋

圖5 KEGG 通路分析

圖6 RELA-木犀草素分子對接

PPI 網絡表明荊銀顆粒多靶點抗病毒的作用特點，網絡中共有73 個關鍵靶點，其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等27 個靶點作用較強。RELA 作用于NF-κB 信號通路。NF-κB 蛋白家族有5 個成員，在正常狀態下，NF-κB沒有轉錄活性，以三聚體的形式存在于細胞質中，NF-κB p65 是NF-κB 蛋白家族的成員之一，參與機體內炎癥反應［16］。Li 等［17］研究發現，1，8-Cineol 通過減弱小鼠肺部炎癥反應來增強對IFV 感染的保護，1，8-Cineol 降低了NF-κB p65、細胞間黏附分子（ICAM）-1 和血管細胞黏附分子（VCAM）-1 在肺組織中的表達，從而預防流感病毒引起的小鼠肺炎。Yang 等［18］在研究鵝掌楸堿調節肺部炎癥的機制中，通過Western blot 檢測NF-κB p65 的磷酸化水平和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，得出鵝掌楸堿治療顯著抑制了肺中VEGF 的表達和NF-κB 的活化。這些研究結果均說明，NF-κB p65 參與肺炎發生過程。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信號通路上［19］。2003 年一種新型冠狀病毒從非典型肺炎患者身上分離出來，被證明是現在稱為嚴重急性呼吸系統綜合癥（SARS）的病原體。利用病理檢測系統研究了AP-1 通路被SARS-CoV N 蛋白激活，因此SARS冠狀病毒核衣殼蛋白與AP-1 信號轉導通路相關，通過激活AP-1 信號轉導通路來調節完整的信號傳導［20］。SARS 冠狀病毒的8 個附屬蛋白可能參與了病毒的發病過程，其中蛋白3b 定位于細胞核，并研究了3b 對AP-1 轉錄活性的影響。研究闡明了在3b 轉染的Huh7 細胞中AP-1 依賴性基因表達的增強，報告基因和移動性轉移檢測顯示，在3b 存在的情況下，AP-1 轉錄和DNA 結合活性增加［21］。

圖7 RELA-靛玉紅分子對接

圖8 RELA-原兒茶醛分子對接

圖9 JUN-木犀草素分子對接

圖10 JUN-靛玉紅分子對接

KEGG 信號通路分析中IL-17 信號通路為主要作用的信號傳導通路。在對多種冠狀病毒研究中，IL-17 信號通路占據重要地位，例如SARS 病毒誘導了模式識別受體和IL-17通路的激活［22］。另外中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERSCoV）被認為是一種感染呼吸道的高致病性病毒，具有很高的發病率和死亡率，動物模型研究表明MERS-CoV 感染可引起強烈的炎癥反應，藥物治療后可相對抑制TNF-α、IL-15、IL-17 等炎癥因子［23］。這些研究均與KEGG 分析結果一致。

圖11 JUN-原兒茶醛分子對接

自2019 年底，起源于武漢的新型肺炎席卷全國，大量信息表明，該肺炎是一種新型冠狀病毒感染所致。冠狀病毒在系統分類上屬冠狀病毒科冠狀病毒屬。冠狀病毒屬的病毒是具外套膜的正鏈單股RNA 病毒，存活力較強，在適宜環境可存活5 d，且其潛伏期最長可達14 d，該病毒主要通過口液、噴嚏、接觸傳染，并通過空氣飛沫傳播，因此其危害性和傳染性較大。已有研究發現新型肺炎從輕癥向重癥發展的時間比較長，因此發病早期是進行抗病毒治療的關鍵時期。雖然目前缺乏完全被證明有效的抗病毒治療手段，但針對發燒、乏力等癥狀，中藥的注射劑、解熱鎮痛的藥物都能發揮重要作用。

荊銀顆粒是由多種解表藥組成，且具有抗病毒、抗炎、解熱、鎮痛等臨床作用，且方中藥物藥性緩和，適用于新型肺炎輕癥時間長的特點。張霞等［24］采用MA-104 細胞感染模型，以利巴韋林為陽性對照藥，檢測到荊芥穗水溶性部位體外抗病毒活性最強。湯奇等［25］觀察并證實了荊芥揮發油對雞胚內和小鼠體內的流感病毒有預防和治療作用。陳智［26］實驗根據細胞病變效應法（CPEF 法）結合CCK-8染色法檢測細胞存活率，驗證了金銀花對于用呼吸道合胞病毒（RSV），柯薩奇病毒B3、B5（COXB3、COXB5），腸道病毒71 型（EV71）4 種病毒感染的人喉癌上皮細胞（Hep2）均有抑制作用。同時本研究通過網絡藥理學結果表明荊銀顆粒多種成分對多種病毒有預防或治療作用，因此荊銀顆粒對新型冠狀病毒感染的肺炎可以起到一定的預防和治療作用，對臨床給藥提供可靠性依據。